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第一部分 基础微生物学实验技术1

实验一 普通光学显微镜的结构与使用1

实验二 培养基的配制与灭菌4

实验三 微生物接种技术与细菌的接种和培养7

实验四 细菌染色与形态观察12

实验五 细菌的芽孢染色与观察15

实验六 放线菌的接种与形态观察15

实验七 酵母菌培养、水浸片制备与形态观察16

实验八 酵母菌活体染色观察及死亡率的测定18

实验九 酵母菌细胞大小及体积的测定18

实验十 酵母菌细胞计数和出芽率的测定20

实验十一 酵母菌子囊孢子的形成与观察22

实验十二 霉菌培养与形态观察23

实验十三 细菌的生理生化实验25

实验十四 细菌菌落总数的测定31

实验十五 大肠菌群的测定33

实验十六 物理因素对微生物生长的影响36

实验十七 化学因素对微生物生长的影响37

实验十八 产蛋白酶的枯草芽孢杆菌的分离38

实验十九 溶源性菌株的检查及噬菌斑的观察39

实验二十 大肠杆菌半乳糖基因高频转导40

实验二十一 紫外线诱变育种——绘制细胞存活率和突变率曲线42

实验二十二 枯草杆菌营养缺陷型突变遗传标记的制作44

实验二十三 大肠杆菌质粒DNA的快速提取及琼脂糖凝胶电泳46

实验二十四 大肠杆菌的遗传转化48

实验二十五 异宗接合型酵母菌的杂交实验49

实验二十六 微生物菌种保藏实验50

第二部分 应用微生物学实验技术51

第一章 显微技术51

第一节 暗视野显微镜的使用51

实验1.1 暗视野显微镜使用举例——细菌运动的观察52

第二节 相差显微镜的使用52

实验1.2 相差显微镜使用举例——酿酒酵母细胞内部结构的观察53

第三节 荧光显微镜的使用54

第四节 电子显微镜的使用55

实验1.3 荧光显微镜使用举例——抗酸细菌的观察55

一、透射电子显微镜（Transmission Electron Microscope,TEM）56

二、扫描电子显微镜（Scanning Electron Microscope,SEM）56

三、扫描透射电镜（Scanning Transmission Electron Microscope,STEM）57

四、扫描隧道显微镜（Scanning Tunneling Microscope,STM）58

实验1.4 电子显微镜的使用举例——电子显微镜样品的制备与观察58

第五节 其它显微镜介绍61

一、偏光显微镜61

二、紫外光显微镜61

三、激光扫描共聚焦显微镜61

第二章 消毒、灭菌及除菌技术62

六、电镜X射线微区分析技术62

四、微分干涉差显微镜62

五、多光子荧光显微镜62

第一节 物理因素除菌的种类及方法63

一、加热除菌63

二、过滤除菌67

三、辐射除菌70

四、超声除菌71

五、微波除菌71

二、化学药物的灭菌原理72

一、优良消毒剂和防腐剂的特点72

第二节 化学药物的消毒与灭菌72

六、低温等离子除菌72

三、化学消毒剂的种类和应用形式73

四、常用消毒剂的使用和灭菌原理73

五、影响消毒剂作用的因素77

六、消毒剂的使用原则78

第三节 各类培养基常采用的灭菌方法及注意事项78

一、各类培养基采用的灭菌方法78

二、培养基灭菌的注意事项78

二、氧化熏蒸79

三、硫熏蒸79

一、福尔马林加热熏蒸79

第四节 无菌室和曲室的消毒与灭菌79

第三章 微生物接种与培养技术80

第一节 微生物的培养技术80

一、好氧性微生物培养方法80

二、厌氧微生物培养方法81

实验3.1 丙酮丁醇梭状芽孢杆菌的厌氧培养84

第二节 连续培养技术86

第三节 同步培养技术87

实验3.2 选择法获得同步生长酵母细胞的实验技术88

第四节 透析培养技术89

实验3.3 诱导法获得霉菌分生孢子同步生长的实验技术89

实验3.4 乳酸杆菌与酵母菌的透析培养91

第五节 高密度培养技术91

实验3.5 产乳球菌素的乳酸乳球菌的膜过滤培养92

第六节 原位分离培养技术93

实验3.6 酿酒酵母酒精发酵的原位分离培养技术94

第七节 补料分批培养技术94

实验3.7 产杆菌肽地衣芽孢杆菌的补料分批培养95

第八节 固体发酵技术96

实验3.8 植酸酶的固体发酵97

实验3.9 蕈菌的栽培技术举例——白灵菇的栽培97

二、染料的种类及选择99

一、染色的基本原理99

第四章 染色技术及微生物细胞结构观察99

第一节 染色技术99

三、制片与染色101

四、活体染色101

实验4.1 酵母的负染色法102

实验4.2 真菌的荧光染色与观察103

实验4.3 细菌的抗酸性染色法103

第二节 微生物细胞结构的观察104

实验4.4 细菌细胞壁染色观察104

实验4.5 细菌荚膜的染色与观察105

实验4.6 细菌鞭毛的染色与观察105

实验4.7 微生物细胞核的染色与观察106

实验4.8 微生物细胞中异染粒的染色与观察107

实验4.9 酵母细胞内脂肪粒的染色与观察107

实验4.10 酵母细胞内肝糖粒的染色与观察108

实验4.11 酵母细胞中液泡的活体染色与观察108

实验4.12 酵母细胞线粒体的活体染色与观察108

实验4.13 毛霉菌的琼脂槽培养法染色与观察109

第五章 微生物生长控制109

第一节 生物量测定109

一、测生长量109

二、计繁殖数110

实验5.1 OD值法测定大肠杆菌肉汤培养基中的生长曲线111

第二节 生长曲线测定111

实验5.2 平板计数法测定酿酒酵母的生长曲线112

实验5.3 菌丝重量法测定丝状真菌的生长曲线114

实验5.4 核酸测定法绘制生长曲线115

第三节 微生物生长代谢影响因素的测定116

实验5.5 营养因素对微生物生长的影响116

实验5.6 接种量对微生物生长的影响117

实验5.7 种龄对微生物生长的影响117

实验5.8 温度对微生物生长和代谢的影响118

实验5.9 pH对微生物生长的影响119

实验5.10 溶解氧对微生物生长的影响120

实验5.11 表面活性剂对微生物生长和代谢的影响121

第六章 微生物纯种分离技术122

第一节 选择培养技术122

一、分离样品的来源122

二、培养条件的控制122

第二节 纯种分离技术123

一、简单平板分离法123

二、稀释倾注分离法123

三、毛细管分离法124

四、小滴分离法124

五、显微操纵单细胞分离技术124

一、新种分离与筛选的方法步骤125

第三节 菌种分离纯化的步骤125

二、纯种的鉴定126

第四节 细菌的分离127

实验6.1 乳酸菌的分离127

实验6.2 酸乳制品中乳酸菌的分离128

实验6.3 分解脂肪的细菌的分离128

实验6.4 水解淀粉的细菌的分离129

实验6.5 醋酸菌的分离130

实验6.6 己酸菌的分离130

实验6.7 固氮菌的分离131

实验6.8 嗜盐菌的分离132

实验6.9 硝化细菌的分离测定134

实验6.10 反硝化细菌的分离135

实验6.11 谷氨酸产生菌的分离136

实验6.12 甲烷代谢菌的分离137

实验6.13 双歧杆菌的分离140

第五节 放线菌的分离144

实验6.14 弹土分离法分离金色链霉菌144

实验6.15 诺卡氏菌的分离145

实验6.16 稀有放线菌的分离146

实验6.17 酒曲中酵母菌的分离147

实验6.18 耐双乙酰啤酒酵母的分离147

第六节 酵母的分离147

实验6.19 耐二氧化硫葡萄酒酵母的分离148

实验6.20 果汁中水解柠檬酸的酵母菌的分离149

第七节 霉菌的分离149

实验6.21 水解蛋白的毛霉的分离149

实验6.22 根霉菌的分离150

实验6.23 产糖化酶的黑曲霉的分离150

实验6.24 产柠檬酸黑曲霉的分离151

实验6.25 烈性噬菌体的分离152

实验6.26 高效价噬菌体裂解液的制备152

第八节 噬菌体的分离152

实验6.27 枯草芽孢杆菌溶源性菌的检查154

第七章 微生物生理生化试验154

第一节 细菌的生理生化实验155

实验7.1 β-半乳糖苷酶试验155

实验7.2 含碳化合物的利用试验155

实验7.3 丙二酸盐试验155

实验7.4 葡萄糖铵试验156

实验7.5 氰化钾试验156

实验7.6 动力试验157

实验7.7 血清学玻片凝集试验157

实验7.9 耐盐性试验158

实验7.8 溶血性试验158

实验7.11 氨基酸脱羧酶试验159

实验7.10 酪蛋白分解试验159

实验7.12 尿素酶试验160

实验7.13 氧化酶试验160

实验7.14 细胞色素氧化酶试验161

实验7.15 过氧化氢酶试验161

实验7.16 TTC试验161

实验7.18 苯丙氨酸脱氨酶试验162

实验7.19 链激酶试验162

实验7.17 卵磷脂酶试验162

实验7.20 马尿酸钠水解试验163

实验7.21 杆菌肽敏感试验163

实验7.22 淀粉水解试验164

实验7.23 精氨酸双水解酶的测定试验164

第二节 放线菌的生理生化实验165

实验7.24 放线菌的生理生化实验165

第三节 酵母的生理生化实验165

实验7.25 糖类发酵试验165

实验7.26 碳源同化试验166

实验7.28 分解杨梅苷的测定167

实验7.29 类淀粉化合物形成的测定167

实验7.27 氮源同化试验167

实验7.30 产酯试验168

实验7.31 分解脂肪试验168

实验7.32 产酸测定168

实验7.33 石蕊牛乳反应169

实验7.34 明胶液化试验169

实验7.35 尿素分解试验169

实验7.36 啤酒酵母发酵力的测定170

实验7.37 酵母菌热死温度的测定171

实验7.39 酵母菌耐酒精能力的测定172

实验7.40 酵母生孢子能力的测定172

实验7.38 酵母菌凝集力的测定172

实验7.41 霉菌产酸试验173

第八章 微生物诱变育种实验173

第一节 诱变育种中的几个问题174

一、出发菌株的选择174

二、细胞悬浮液的制备174

三、诱变剂的选择及处理方法的选择175

四、中间培养178

五、突变型菌株的分离178

第二节 突变型菌株的分离183

实验8.1 抗反馈调节突变株赖氨酸高产菌株的筛选183

实验8.2 抗生素效价的生物测定（管碟法）184

实验8.3 耐高浓度自身代谢产物的抗反馈抑制突变型卡那霉素高产菌株的选育186

实验8.4 大肠杆菌链霉素抗性标记的制作187

实验8.5 酿酒酵母呼吸缺失突变株的选育188

实验8.6 酱油曲霉温度敏感型突变株的选育189

第九章 微生物细胞水平基因重组育种190

第一节 细菌的转化190

实验9.1 枯草杆菌质粒DNA的提取192

实验9.2 地衣芽孢杆菌染色体DNA的提取193

实验9.3 枯草杆菌染色体DNA的转化194

实验9.4 枯草杆菌原生质体的转化195

第二节 细菌的转导196

实验9.5 枯草杆菌噬菌体的普遍转导197

第三节 细菌的接合198

实验9.6 大肠杆菌Hfr品系的建立199

实验9.7 大肠杆菌的接合200

第四节 酵母菌的杂交育种202

一、酵母的生活史202

二、酵母有性杂交技术203

实验9.8 糖化酵母单倍体细胞分离与遗传标记制作204

实验9.9 同宗接合型酵母株的杂交206

实验9.10 应用多次回交法选育嗜杀清酒酵母株207

第五节 霉菌的杂交育种208

一、霉菌的准性生殖过程208

二、霉菌的杂交育种209

第六节 微生物细胞融合技术210

实验9.11 细菌原生质体细胞融合214

实验9.12 酵母菌原生质体细胞融合215

实验9.13 利用核融合缺陷细胞融合法选育嗜杀葡萄酒酵母菌株216

实验9.14 应用原生质体细胞融合技术选育酱油曲霉220

实验9.15 电诱导酵母菌与短梗霉属属间融合221

第十章 基因工程育种222

第一节 概述222

一、重组DNA中常用的工具酶222

一、目的基因的获取223

二、DNA分子的体外连接223

第二节 基因工程基本操作步骤223

二、载体－宿主系统223

三、重组DNA导入宿主菌224

四、重组克隆的筛选与鉴定224

第三节 生物信息数据库与查询225

一、概述225

二、生物信息数据库与查询225

实验10.1 酵母菌DNA的提取及检测227

实验10.2 丝状真菌总RNA的提取及检测229

实验10.3 PCR方法获得微生物的目的基因230

实验10.4 RT-PCR获得真核生物的目的基因232

实验10.5 利用标记的探针获得目的基因234

实验10.6 体外基因重组及在大肠杆菌中的克隆235

实验10.7 原核表达载体构建及在宿主中表达238

实验10.8 真核表达载体构建及在宿主中表达239

实验10.9 mRNA差别显示技术241

实验10.10 微生物cDNA文库构建技术244

实验10.11 PCR定点突变技术改造微生物菌种247

实验10.12 丝状真菌的转化技术248

第十一章 分子杂交技术249

第一节 核酸探针的种类与标记方法249

一、核酸探针的种类249

二、核酸探针的标记和检测250

实验11.1 用切口平移法标记双链DNA探针252

实验11.2 随机引物延伸法进行纯化DNA片段的放射性标记253

实验11.3 利用聚合酶链反应制备放射性标记的DNA探针255

实验11.4 从RNA合成单链cDNA探针256

第二节 核酸分子杂交类型257

一、固相核酸分子杂交类型257

二、液相核酸分子杂交类型260

第三节 分子杂交基本操作步骤和杂交实验因素的优化261

一、固相膜核酸分子杂交方法261

二、核酸分子杂交实验因素的优化261

实验11.5 Southern杂交实验263

实验11.6 Northern杂交实验265

第十二章 微生物免疫及现代检测技术269

第一节 抗体的制备269

实验12.1 乳化抗原的制备270

实验12.2 抗血清的制备271

实验12.3 杂交瘤与单克隆抗体的制备273

第二节 抗体的纯化277

实验12.4 抗血清中IgG的分离与纯化277

第三节 凝集反应试验方法278

实验12.5 玻片凝集反应试验278

实验12.6 单向琼脂扩散试验279

第四节 沉淀反应检测方法279

第五节 酶联免疫吸附技术280

实验12.7 夹心ELISA测定乙型肝炎表面抗原的实验281

第六节 免疫胶体金技术283

实验12.8 免疫金银染色法283

第七节 免疫印迹285

实验12.9 免疫印迹285

第十三章 微生物分类技术288

实验13.1 热变性温度法测定GC含量288

实验13.2 原核微生物16S rRNA基因的分离及序列分析289

实验13.3 真核微生物18S rRNA基因的分离及序列分析291

实验13.4 DNA杂合法在分类中的应用292

实验13.5 细胞壁成分分析在分类中的应用293

实验13.6 红外吸收光谱法在微生物分类中的应用294

实验13.7 利用微生物快速测定仪对微生物进行分类295

第十四章 食品卫生微生物学检测296

第一节 总则296

一、采样用具296

二、样品的采集296

三、送检299

四、检验299

第二节 各类微生物检验法299

实验14.1 沙门氏菌属（Salmonella）的检验300

实验14.2 志贺氏菌属（Shigella）的检验309

实验14.3 致泻大肠埃希氏菌（Diarrheogenic Escherichia coli）的检验312

实验14.4 副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）的检验315

实验14.5 小肠结肠炎耶尔森氏菌（Yersinia enterocolitica）的检验318

实验14.6 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的检验320

实验14.7 溶血性链球菌（Streptococcus hemolyticus）的检验321

实验14.8 肉毒梭菌（Clostridium borulinum）及肉毒毒素的检验323

实验14.9 蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）的检验325

实验14.10 霉菌和酵母的计数328

实验14.11 水的细菌学检验330

实验14.11(1) 水中细菌总数的测定330

第三节 食品加工和发酵生产环境的卫生学检验330

实验14.11(2) 多管发酵法测定水中大肠菌群331

实验14.11(3) 滤膜法测定水中大肠菌群335

实验14.12 空气中的微生物检测336

第十五章 微生物菌种保藏338

第一节 普通菌种保藏方法338

一、定期移植保藏法338

二、沙管保藏法339

三、液体石蜡保藏法340

四、液氮保藏法341

五、冷冻真空干燥保藏法342

第二节 特殊菌种保藏方法344

一、噬菌体的保藏法344

六、悬液保藏法344

八、孢子滤纸保藏法344

七、木粒麸皮保藏法344

二、厌氧性细菌的保藏法345

附录348

Ⅰ．染色液及其配制348

Ⅱ．培养基349

Ⅲ．生理生化实验培养基及试剂355

Ⅳ．食品卫生微生物学检测用培养基、试剂及染色液359

主要参考书目365