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第1章 电泳概论1

1.1 电泳的早期历史1

1.2 电泳的简单原理及分类5

1.3 凝胶电泳技术的历史7

参考文献8

第2章 凝胶电泳的支持介质11

2.1 聚丙烯酰胺凝胶的形成和结构11

2.2 丙烯酰胺和N,N′-甲叉双丙烯酰胺的纯化和毒性14

2.3 引发剂、增速剂和聚合15

2.4 聚丙烯酰胺凝胶的有效孔径和分子筛效应17

2.5 琼脂糖凝胶的性能、结构与特点18

2.6 电泳新介质23

参考文献25

第3章 凝胶电泳仪器的进展27

3.1 电泳槽27

3.1.1 圆盘电泳28

3.1.2 垂直电泳29

3.1.3 水平电泳31

3.1.4 垂直与水平平板电泳的比较33

3.2 各种灌胶模具34

3.3 电源35

3.4 外循环恒温系统35

3.5 自动凝胶染色仪36

3.6 凝胶干燥仪36

3.7 电泳转移仪36

3.8 电泳洗脱仪37

3.9 制备电泳仪37

3.10 凝胶扫描和摄录装置38

3.11 从双向电泳凝胶中自动切取蛋白斑点的仪器39

参考文献41

第4章 常规聚丙烯酰胺凝胶电泳42

4.1 原理42

4.1.1 蛋白质的电泳行为42

4.1.2 原理43

4.1.3 缓冲系统的选择44

4.1.3.1 pH的选择44

4.1.3.2 离子强度的选择46

4.1.4 凝胶浓度的选择47

4.1.4.1 浓缩胶与分离胶48

4.1.4.2 浓缩胶的作用原理48

4.1.4.3 均一胶和梯度胶49

4.1.5 连续电泳和不连续电泳49

4.1.6 分子质量测定51

4.2 方法53

4.2.1 制胶53

4.2.1.1 垂直平板电泳的制胶53

4.2.1.2 水平平板电泳的制胶56

4.2.2 样品的准备60

4.2.2.1 选择合适的样品缓冲液60

4.2.2.2 蛋白标准的准备60

4.2.2.3 样品浓度60

4.2.2.4 加样要求61

4.2.3 电泳61

4.2.3.1 垂直电泳61

4.2.3.2 水平电泳61

4.2.4 检测62

4.2.4.1 早期染色方法62

4.2.4.2 考马斯亮蓝染色63

4.2.4.3 银染色66

4.2.4.4 其他染色方法69

4.2.4.5 一些蛋白的染色方法70

4.2.4.6 同工酶染色72

4.2.4.7 荧光探针法75

4.2.4.8 免疫方法76

4.2.4.9 电泳转移77

4.2.4.10 电泳后蛋白带的氨基酸分析77

4.2.5 照相、凝胶干燥78

4.2.6 定量测定78

4.3 实验考虑79

4.3.1 电泳方法和方式的选择79

4.3.2 最佳凝胶浓度和缓冲系统的选择79

4.3.3 凝胶聚合不佳的原因和对策80

4.3.4 样品的预处理81

4.3.5 阳极电泳和阴极电泳81

4.3.6 半干技术81

4.3.7 检测方法的选择83

4.3.8 电泳过程中的不正常现象和对策83

4.3.9 电泳结果的分析84

参考文献86

第5章 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳92

5.1 原理92

5.1.1 蛋白质分子的解聚92

5.1.2 缓冲系统的选择94

5.1.3 凝胶浓度的选择95

5.1.4 分子质量测定96

5.1.4.1 分子质量测定的理论背景96

5.1.4.2 蛋白标准96

5.1.4.3 分子质量的计算99

5.1.5 低分子质量多肽的SDS电泳99

5.2 方法100

5.2.1 制胶（用于垂直电泳或水平电泳）100

5.2.2 样品的准备103

5.2.2.1 样品缓冲液的配制103

5.2.2.2 蛋白标准的准备104

5.2.2.3 样品浓度和加样要求104

5.2.3 电泳104

5.2.3.1 垂直电泳104

5.2.3.2 水平电泳105

5.2.4 检测106

5.2.4.1 考马斯亮蓝染色106

5.2.4.2 银染色107

5.2.4.3 其他染色方法108

5.2.4.4 荧光探针法109

5.2.4.5 电泳转移109

5.2.4.6 电泳后蛋白带的氨基酸组成和序列分析109

5.2.4.7 电泳后的肽图分析110

5.2.5 照相、凝胶干燥110

5.2.6 定量测定110

5.3 实验考虑110

5.3.1 SDS电泳是测定蛋白质亚基分子质量的最佳选择110

5.3.2 凝胶浓度和缓冲系统的选择111

5.3.3 SDS聚丙烯酰胺凝胶聚合不佳的原因对策112

5.3.4 SDS-琼脂糖凝胶电泳112

5.3.5 去污剂的选择112

5.3.5.1 阳离子和阴离子去污剂112

5.3.5.2 非离子去污剂113

5.3.5.3 酸-尿素去污剂113

5.3.5.4 电荷位移电泳114

5.3.6 样品的处理114

5.3.6.1 还原SDS处理114

5.3.6.2 带有烷基化作用（alkylation）的还原SDS处理115

5.3.6.3 非还原的SDS处理115

5.3.7 半干技术116

5.3.8 检测方法的选择116

5.3.9 生物活性的恢复117

5.3.9.1 在凝胶中恢复活性117

5.3.9.2 电泳转移后恢复生物活性118

5.3.9.3 洗脱后在自由溶液中恢复生物活性118

5.3.10 电泳过程中的不正常现象和对策118

5.3.11 电泳结果的分析118

参考文献118

第6章 载体两性电解质pH梯度等电聚焦122

6.1 原理122

6.1.1 蛋白质的等电点122

6.1.2 等电聚焦——在pH梯度中的电泳123

6.1.3 等电聚焦的分辨率124

6.2 载体两性电解质和pH梯度的形成125

6.2.1 历史125

6.2.2 合成126

6.2.2.1 Ampholine的合成（原瑞典LKB公司）126

6.2.2.2 Pharmalyte的合成（原瑞典Pharmacia公司）127

6.2.2.3 Servalyte的合成（德国Serva公司）128

6.2.2.4 实验室合成128

6.2.3 特性128

6.2.3.1 分子质量小128

6.2.3.2 可溶性好129

6.2.3.3 缓冲能力强129

6.2.3.4 导电性均匀129

6.2.3.5 紫外吸收低，不发荧光130

6.2.3.6 容易从聚焦的蛋白带中除去130

6.2.3.7 无毒、无生物学效应130

6.2.3.8 螯合性质130

6.2.4 pH梯度的形成130

6.3 薄层分析等电聚焦的方法132

6.3.1 聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦132

6.3.1.1 制胶132

6.3.1.2 等电聚焦134

6.3.1.3 pH梯度测定135

6.3.1.4 固定、染色、脱色135

6.3.1.5 保存136

6.3.2 琼脂糖凝胶等电聚焦136

6.3.2.1 制胶136

6.3.2.2 等电聚焦137

6.3.2.3 pH梯度的测定138

6.3.2.4 固定、染色、脱色、保存138

6.4 实验考虑139

6.4.1 稳定介质的选择139

6.4.2 稳定介质的电内渗139

6.4.3 载体两性电解质和pH梯度范围的选择141

6.4.4 丙烯酰胺的聚合142

6.4.5 电极溶液143

6.4.6 四甲基乙二胺（TEMED）对丙烯酰胺凝胶的聚合和pH梯度的影响（扩展pH梯度碱性侧）144

6.4.7 样品的预处理145

6.4.8 加样方法147

6.4.9 电参数（电压、电流、功率、温度和时间）148

6.4.10 pH梯度和pI的测定151

6.4.11 聚焦后的检测152

6.4.11.1 各种染色方法152

6.4.11.2 扫描与定量153

6.4.11.3 电泳转移153

6.4.11.4 双向电泳154

6.4.11.5 滴定曲线154

6.4.12 聚焦过程中出现的问题及解决办法154

6.4.12.1 聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦154

6.4.12.2 琼脂糖凝胶等电聚焦157

参考文献158

第7章 固相pH梯度等电聚焦162

7.1 原理162

7.1.1 固相pH梯度介质的结构和合成162

7.1.2 Immobiline的物化特性165

7.1.3 固相pH梯度的原理168

7.1.3.1 Henderson-Hasselbalch公式168

7.1.3.2 一个pH范围的固相pH梯度168

7.1.3.3 窄范围和宽范围的pH梯度171

7.1.3.4 固相pH梯度的计算机模拟173

7.1.4 分辨率173

7.2 方法177

7.2.1 制胶177

7.2.1.1 选择pH范围，计算缓冲与滴定Immobiline的体积177

7.2.1.2 贮液配置177

7.2.1.3 模具组装和凝胶溶液的配制177

7.2.1.4 灌胶178

7.2.1.5 洗胶和吹胶178

7.2.2 等电聚焦179

7.2.3 pH梯度的测定180

7.2.4 检测180

7.2.4.1 各种染色方法180

7.2.4.2 凝胶干燥与保存180

7.2.4.3 扫描与定量180

7.2.4.4 双向电泳180

7.2.4.5 电泳转换180

7.3 实验考虑181

7.3.1 固相pH梯度的优缺点181

7.3.2 pH范围的选择182

7.3.3 灌胶与聚合182

7.3.4 洗胶与干胶183

7.3.5 离子强度、缓冲能力和导电性184

7.3.6 电内渗184

7.3.7 蛋白质的可溶性和添加剂185

7.3.8 盐对固相pH梯度等电聚焦的影响186

7.3.9 电参数187

7.3.10 等电点的实验测定188

7.3.11 与质谱联用188

7.3.12 电泳过程中出现的问题和解决方法189

7.4 等电聚焦技术的进展189

7.4.1 第一代等电聚焦190

7.4.2 第二代等电聚焦190

7.4.3 第三代等电聚焦190

7.4.4 第四代等电聚焦191

参考文献191

第8章 双向电泳195

8.1 原理195

8.1.1 O'Farrell系统——ISO-DALT系统197

8.1.2 IPG-DALT系统198

8.2 方法199

8.2.1 ISO-DALT方法199

8.2.1.1 等电聚焦凝胶的准备199

8.2.1.2 样品准备和加样199

8.2.1.3 等电聚焦199

8.2.1.4 pH梯度的测定200

8.2.1.5 平衡200

8.2.1.6 SDS凝胶的准备200

8.2.1.7 二向间的转移200

8.2.1.8 SDS电泳200

8.2.1.9 检测200

8.2.2 IPG-DALT方法201

8.2.2.1 固相pH梯度凝胶或凝胶条的准备201

8.2.2.2 IPG凝胶干胶条的再水化（泡胀）&..202

8.2.2.3 样品制备203

8.2.2.4 等电聚焦204

8.2.2.5 pH梯度的测定206

8.2.2.6 平衡206

8.2.2.7 SDS电泳206

8.2.2.8 检测207

8.2.2.9 蛋白斑点的后续分析208

8.3 实验考虑209

8.3.1 双向电泳的次序209

8.3.2 非平衡pH梯度电泳（NEPHGE）209

8.3.3 管状、垂直与水平方式的比较209

8.3.4 ISO-DALT和IPG-DALT212

8.3.5 用一个省时、省材料的技术路线起始双向电泳实验213

8.3.6 变性剂、去污剂和还原剂213

8.3.7 样品的处理215

8.3.7.1 破碎215

8.3.7.2 防止蛋白质水解216

8.3.7.3 沉淀蛋白218

8.3.7.4 清除污染物219

8.3.7.5 样品制备中的多级分离224

8.3.8 聚焦参数224

8.3.9 IPG-DALT系统第一向电泳时的油层覆盖224

8.3.10 二向间的平衡和转移225

8.3.11 双向电泳蛋白质标准226

8.3.12 点的延长和扩散227

8.3.13 纹理现象227

8.3.14 荧光染色227

8.3.15 在双向凝胶电泳中的荧光差异技术228

参考文献232

第9章 滴定曲线237

9.1 概念237

9.2 方法239

9.3 实验考虑240

9.3.1 在8mol/L尿素和去污剂中的滴定曲线240

9.3.2 大分子的滴定曲线240

9.3.3 用琼脂糖作为支持介质240

参考文献241

第10章 免疫电泳242

10.1 原理242

10.1.1 免疫电泳基础242

10.1.2 单免疫扩散-Mancini技术243

10.1.3 双扩散-Ouchterlony技术243

10.1.4 Grabar和Williams免疫电泳245

10.1.5 “火箭”免疫电泳245

10.1.5.1 Laurell“火箭”免疫电泳245

10.1.5.2 融合“火箭”免疫电泳246

10.1.6 交叉免疫电泳247

10.1.6.1 Clarke和Freeman交叉免疫电泳247

10.1.6.2 串联交叉免疫电泳248

10.1.7 反向免疫电泳248

10.2 方法248

10.2.1 溶液的准备248

10.2.2 倒胶249

10.2.3 打孔与加样249

10.2.4 电泳249

10.2.5 检测249

10.3 实验考虑250

10.3.1 支持介质250

10.3.2 缓冲系统250

10.3.3 抗体和抗血清250

10.3.4 方法的选择251

10.3.5 “Laying-on”技术251

10.3.6 媒介凝胶技术251

10.3.7 免疫沉淀的观察252

参考文献253

第11章 蛋白质印迹255

11.1 原理255

11.1.1 几种印迹方法256

11.1.1.1 点印迹256

11.1.1.2 扩散印迹256

11.1.1.3 溶剂流印迹257

11.1.1.4 电泳印迹257

11.1.2 固定化材料258

11.1.2.1 硝化纤维素膜258

11.1.2.2 尼龙膜259

11.1.2.3 DBM和DPT纸259

11.1.2.4 PVDF膜259

11.1.3 转移缓冲液260

11.1.4 封阻、标记和检测260

11.2 方法261

11.2.1 从SDS凝胶上转移蛋白质261

11.2.1.1 溶液配置261

11.2.1.2 转移单元的组成261

11.2.1.3 电参数262

11.2.2 从琼脂糖凝胶上转移蛋白质262

11.2.2.1 溶液配置262

11.2.2.2 转移单元的组成262

11.2.2.3 电参数262

11.2.3 从等电聚焦凝胶上转移蛋白质262

11.2.3.1 溶液配置262

11.2.3.2 转移单元的组成262

11.2.3.3 电参数262

11.2.4 检测263

11.3 实验考虑263

11.3.1 电泳转移的效率263

11.3.2 转移缓冲液263

11.3.3 封阻264

11.3.4 探针265

11.3.5 总蛋白染色266

11.3.6 转移膜的塑料包埋和透明化267

11.3.6.1 溶液和材料267

11.3.6.2 操作268

11.3.7 垂直槽式和水平半干式电泳印迹268

11.3.8 印迹过程中出现的问题及解决办法268

参考文献270

第12章 制备电泳274

12.1 洗脱274

12.1.1 扩散洗脱274

12.1.2 电泳洗脱274

12.2 连续电泳275

12.2.1 连续洗脱电泳275

12.2.2 连续自由流动电泳275

12.2.3 空间电泳275

12.3 等电聚焦制备电泳275

12.3.1 液体介质275

12.3.2 凝胶介质276

12.3.3 方法276

12.3.4 实验考虑278

12.3.5 固相pH梯度制备等电聚焦278

12.4 样品的均一性279

参考文献279