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目录1

绪论1

第一部分　植物基因资源的开发7

第一章 植物RNA的分离和纯化7

第一节 植物RNA分离纯化的一般性原则7

第二节 几种代表性植物RNA分离纯化程序9

一、拟南芥RNA的分离纯化9

二、烟草RNA的快捷分离纯化10

三、水稻组织RNA的分离纯化11

四、禾谷类种子中RNA的分离纯化13

五、林木类被子植物和裸子植物RNA的分离纯化14

参考文献16

第二章　cDNA文库的构建18

第一节 一般cDNA文库构建18

一、一般cDNA文库构建方法18

二、注意要点23

一、CloneMinerTM cDNA文库构建模式24

第二节 cDNA文库构建的新技术24

二、CreatorTM SMARTTM cDNA文库构建模式26

第三节 均一化cDNA文库和差减cDNA文库的构建28

第四节 cDNA文库的均一化与消减化的实验操作程序29

一、仪器29

二、材料试剂29

三、注意事项30

四、步骤30

参考文献35

第一节 概述36

第三章 生物芯片技术——长寡核苷酸片段芯片法36

第二节 长寡核苷酸型芯片实验37

一、实验所需主要材料、设备37

二、实验步骤37

参考文献40

第四章　RNA干扰技术41

第一节 植物稳定转化载体的设计策略41

一、靶基因RNA内部发夹状反向重复载体42

二、异源3′-末端非编码区诱发的靶基因的沉默42

一、农杆菌介导的瞬时表达系统44

第二节 植物瞬时表达载体的设计策略44

二、病毒诱导的基因沉默系统45

三、基因枪介导的瞬时表达系统46

第三节 植物RNA干扰的生化分析46

一、材料47

二、方法50

三、注释58

参考文献58

一、酸性条件提取方法60

第一节 一般目的基因组DNA的分离纯化60

第五章　基因组DNA的分离纯化技术60

二、CTAB提取法61

三、PVP提取法62

四、CTAB裂解的阴离子交换树脂法63

五、SDS裂解的阴离子交换树脂法64

六、尿素提取法64

七、其他方法65

第二节 高分子量基因组DNA的分离纯化65

二、提取步骤66

一、所需试剂66

三、高分子量DNA的电泳检查：脉冲电泳67

参考文献67

第六章　基因组DNA文库的构建技术68

第一节 基因组DNA文库的克隆系统68

一、细菌-质粒克隆系统68

二、YAC克隆系统71

三、P1噬菌体克隆系统71

一、百万碱基级核DNA制备72

第二节 细菌大片段基因组DNA文库的构建72

二、载体的制备73

三、文库构建76

第三节 基因组物理作图80

一、重复杂交法80

二、荧光原位杂交法81

三、光学作图法81

四、染色体步移法82

五、以DNA标记为基础的染色体着陆法82

六、测序法83

八、HAPPY作图法84

七、放射杂交体作图84

九、DNA指纹图谱法85

参考文献86

第七章　基因遗传定位技术——分子标记及其应用91

第一节 分子标记类型91

一、限制性片段长度多态性91

二、随机扩增多态性DNA92

三、简单序列重复92

六、序列标签位点93

七、序列特异性扩增区93

四、DNA扩增指纹93

五、任意引物PCR93

八、割裂扩增多态性序列94

九、单引物扩增反应94

十、扩增片段长度多态性94

十一、单特征多态性94

十二、单核苷酸多态性94

一、基因组作图95

第二节 分子标记在植物研究中的应用95

二、基因定位96

三、基因克隆97

四、在遗传多样性和进化研究上的应用97

第三节 遗传作图上广泛使用的分子标记实验技术98

一、RFLP98

二、随机扩增多态DNA101

三、SSR分子标记102

四、AFLP109

五、REMAP和IRAP119

六、SRAP120

七、SNP121

参考文献122

第八章　植物基因启动子的PCR克隆技术127

第一节 概况127

第二节 植物启动子克隆的几种PCR方法128

一、启动子克隆的反向PCR方法128

二、启动子克隆的TAIL-PCR方法133

三、接头连接介导的PCR散步法137

参考文献141

第九章　植物蛋白的双向凝胶电泳分离和指纹质谱分析143

一、基本原理144

二、材料144

第一节 植物蛋白质双向凝胶电泳分离144

三、方法146

第二节 双向凝胶蛋白质点的切取、胶内酶解和多肽片段的纯化150

一、基本原理150

二、材料151

三、方法151

二、材料153

第三节 蛋白质指纹质谱分析153

一、基本原理153

三、方法154

第四节 总结与讨论159

参考文献160

第十章 酵母双杂交系统161

第一节 概况161

第二节 酵母双杂交系统的研究方法163

一、基本材料163

二、基本设备164

三、构建“目标基因”载体165

四、酵母转化167

五、检测“目标基因”在酵母中表达167

六、构建“捕获”cDNA文库170

七、酵母双杂交筛选相互作用蛋白171

八、总结173

参考文献173

二、根癌农杆菌介导的基因转化及分子机理177

一、根癌农杆菌的生物学特性177

第一节 根癌农杆菌介导的转化技术发展与现状177

第十一章　根癌农杆菌介导的转化技术177

第二部分　植物基因的转化177

三、根癌农杆菌在植物基因工程中的应用178

第二节 根癌农杆菌介导的基因转化方法180

一、根癌农杆菌的操作180

二、根癌农杆菌渗透转化拟南芥的方法184

三、根癌农杆菌转化烟草的方法185

四、根癌农杆菌介导的大豆子叶节转化系统187

五、根癌农杆菌介导的玉米转化190

六、根癌农杆菌介导的针叶树转化192

参考文献195

第十二章　发根农杆菌介导的植物转化202

第一节 发根农杆菌转化系统——技术与应用状况202

一、双元载体的转化系统202

二、多自动转化载体系统203

三、从发状根再生植株204

四、发状根系在液体培养基中扩增204

五、影响发根农杆菌转化效率的因素205

六、结论206

第二节 拟南芥转化发状根的产生、维持与转化植株再生207

一、仪器设备207

二、试剂及培养基207

三、实验程序207

参考文献208

第十三章 以基因枪为工具的转化技术213

第一节 微粒轰击法的原理方法及其对植物科学及生物技术的影响213

一、微粒轰击技术的发展213

二、微粒轰击技术的应用215

三、影响微粒轰击过程的主要生物及物理因素216

四、微粒轰击产生的转基因整合及表达218

五、微粒轰击法实际应用中轰击能力的开发220

六、微粒轰击与农杆菌介导的基因转移221

七、结论222

第二节 微粒轰击介导的小麦转化方法222

一、设备与仪器222

二、材料和试剂222

三、实验程序223

参考文献225

第十四章 以原生质体为基础的转化技术231

第一节 利用gus报告基因及小麦原生质体瞬时表达系统分析启动子功能232

一、设备与仪器233

二、试剂、培养基及组织培养用品233

三、小麦悬浮细胞培养物的制备与维持234

四、实验程序234

第二节 原生质体化学融合技术235

一、仪器设备235

二、试剂235

二、试剂236

一、仪器设备236

三、实验程序236

四、注意事项236

第三节 原生质体电融合技术236

三、实验程序237

四、注意事项237

参考文献237

第十五章　叶绿体和其他植物转化技术239

第一节 叶绿体基因转化技术239

一、叶绿体基因组及起源239

二、叶绿体基因转化的历史及现状239

三、叶绿体转化载体的构建240

四、叶绿体转化的应用241

第二节 其他植物转化方法241

一、显微注射242

二、胚电泳242

五、脂质体介导的转化243

六、硅碳化合物纤维介导的转化243

三、细胞和组织的电激243

四、花粉管通道介导的转化243

七、结论244

第三节 硅碳化合物纤维WHISKERS介导的玉米转化实验244

一、仪器设备245

二、试剂245

三、实验步骤245

参考文献246

第一节 聚合酶链反应253

一、PCR技术简史253

第十六章 目的基因整合的分析253

第三部分　转基因植物的分析和应用253

二、PCR技术的原理254

三、PCR反应系统的组成255

四、PCR反应参数258

五、标准PCR扩增反应程序259

六、PCR反应特点259

第二节 Southern杂交260

一、放射性同位素标记法260

二、非放射性地高辛标记DNA探针法271

参考文献275

第一节 原位杂交技术的原理与应用276

一、原位杂交技术提供外源基因在染色体上的直接证据276

二、原位杂交技术对基因转化规律的分析276

第十七章　原位杂交技术对染色体上外源基因的定位及结构分析276

三、原位杂交技术对外源基因插入位点的结构分析277

四、原位杂交技术在转基因分析中的限制因素278

一、根尖染色体的制作（滴片法）279

二、荧光探针的标记（缺口转移法）279

第二节 转基因玉米中外源DNA的FISH检测实验279

三、原位杂交及信号观察280

参考文献280

第十八章 目的基因的转录分析282

第一节　Northern杂交282

一、历史沿革和实践意义282

二、方法原理282

三、仪器和试剂283

四、实验过程283

一、历史沿革和实践意义284

第二节 反转录-聚合酶链反应284

五、结果讨论284

二、方法原理285

三、仪器和试剂285

四、实验过程285

五、结果讨论285

第三节 RNA保护反应286

一、历史沿革和实践意义286

二、方法原理286

四、实验过程287

三、仪器和试剂287

五、结果讨论288

第四节 RNA原位杂交288

一、历史沿革和实践意义288

二、方法原理289

三、仪器和试剂289

四、实验过程289

五、结果讨论290

参考文献291

一、植物蛋白质的SDS提取方法292

第十九章 目的基因蛋白质表达产物的分析292

第一节 Western blot分析292

二、植物蛋白质浓度测定的Bradford方法293

三、植物蛋白质的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）分析294

四、植物蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶的染色方法297

五、SDS-聚丙烯酰胺蛋白质凝胶的Western blot转移方法299

六、运用碱性磷酸酶偶联第二抗体检测Western膜上的目的蛋白300

七、运用辣根过氧化物酶偶联第二抗体的化学显色法测定Western膜上的目的蛋白301

八、运用辣根过氧化物酶偶联第二抗体和增强的化学发光法检测Western膜上的目的蛋白302

第二节 目的蛋白的组织免疫学定位分析303

一、植物组织切片的免疫金粒标记技术304

二、用荧光偶联的第二抗体检测目的蛋白305

三、植物组织切片的免疫过氧化物酶标记308

第三节 免疫PCR技术检测转基因植物中的蛋白表达308

一、免疫PCR体系的组成、试剂与操作步骤308

二、注意事项310

参考文献311

第一节 β-葡萄糖苷酶基因312

一、组织化学法测定GUS活性312

第二十章　报告基因的检测分析312

二、荧光法测定GUS活性313

三、gus基因的应用314

第二节 绿色荧光蛋白基因314

第三节 荧光素酶基因316

一、luc基因的检测原理及步骤316

二、luc基因的应用317

第四节 新霉素磷酸转移酶基因317

二、检测步骤318

一、npt-Ⅱ基因的检测原理318

第五节 氯霉素乙酰转移酶基因319

一、cat基因的检测原理及步骤319

二、说明322

三、cat基因的应用322

第六节 其他的报告基因322

一、抗除草剂基因322

二、β-半乳糖苷酶基因323

三、潮霉素磷酸转移酶基因324

参考文献324