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上篇 蛋白质化学3

第一章 蛋白质的表征3

第一节 蛋白质结构的基本概念3

第二节 蛋白质的纯度6

第三节 蛋白质的定量7

一、光吸收法8

二、双缩脲法8

三、福林-酚法8

四、考马斯亮蓝G-250法9

五、氨基酸分析法9

第四节 蛋白质的脱盐（除去盐和非共价结合的小分子）9

第五节 蛋白质的分子质量测定10

第六节 蛋白质的等电点测定11

第七节 氨基酸定量分析12

第八节 肽谱14

第九节 质谱16

第十节 蛋白质及多肽的序列测定和末端分析18

一、N端分析19

二、C端的测定19

第十一节 蛋白质的二硫键分析19

一、不同同位素标记法20

二、4-乙烯吡啶标记法20

三、直接色谱法21

四、质谱法21

第十二节 突变点的分析22

第十三节 原位分析和快速分析24

一、原位分析24

二、快速分析24

第十四节 蛋白质翻译后修饰的分析25

参考文献25

第二章 蛋白质结构分析27

第一节 蛋白质样品的准备27

一、SDS-PAGE纯化的样品27

二、HPLC纯化的样品27

三、蛋白质样品中的二硫键和巯基（—SH）27

第二节 蛋白质的化学裂解28

一、裂解于甲硫氨酸（Met）28

二、裂解于半胱氨酸（Cys）29

三、裂解于色氨酸（Trp）30

四、部分酸水解30

五、选择性及限制性化学裂解30

第三节 蛋白水解酶酶解31

一、常用蛋白水解酶31

二、酶解操作条件31

三、讨论32

第四节 蛋白质中存在着封闭的N端33

一、除去蛋白质中封闭的N-乙酰丝氨酸和N-乙酰苏氨酸33

二、除去N-甲酰甲硫氨酸33

三、除去N端的焦谷氨酸残基（pyroglutamate）33

四、除去其他的N-乙酰氨基酸34

五、选择性纯化N端封闭的肽34

第五节 蛋白质中的C端残基的测定34

一、羧肽酶法34

二、化学降解法35

第六节 蛋白质中一些特殊肽段的检出35

一、含巯基肽的分离纯化和分析35

二、含芳香族氨基酸肽的分离纯化和鉴定37

三、含Lys-肽的分离纯化和鉴定40

参考文献42

附录一 微量蛋白质实验室注意事项44

附录二 常用试剂处理44

第三章 氨基酸组成分析46

第一节 氨基酸组成分析的目的46

第二节 蛋白质的水解方法46

第三节 特殊氨基酸的保护和定量48

第四节 氨基酸组成原位分析50

第五节 衍生方法及原理50

第六节 测定氨基酸组成的实验步骤52

一、OPA法52

二、PTC-AA法53

三、茚三酮法54

四、氨基酸直接分析法55

第七节 结语55

参考文献56

第四章 蛋白质和多肽的氨基酸序列测定57

第一节 N端分析原理57

一、耦联57

二、裂解57

三、转化58

四、PTH-氨基酸的鉴定58

第二节 N端蛋白质序列仪58

一、液相旋转杯序列仪58

二、固相序列分析仪59

三、气相序列仪59

第三节 影响N端Edman反应裂解率的因素60

第四节 测序前样品处理62

一、纯度鉴定62

二、脱盐62

三、巯基修饰方法62

四、去除N端封闭的基团的方法63

第五节 手工N端测序64

第六节 C端序列分析67

一、C端分析原理67

二、C端蛋白质序列仪69

三、C端测序的样品前处理69

四、影响C端测序反应产率的因素72

五、结语和展望72

参考文献73

第五章 薄层等电聚焦74

第一节 原理74

第二节 薄层IEF75

一、仪器75

二、试剂和储存液配制75

三、制胶模具的准备75

四、凝胶的制备76

五、加样76

六、电泳76

七、染色和脱色76

八、凝胶保存77

第三节 等电聚焦中的注意事项77

第四节 IEF的优缺点77

第五节 实例78

参考文献79

第六章 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳80

第一节 概况80

第二节 材料80

一、设备和材料80

二、试剂81

第三节 基本操作步骤81

一、聚胶前准备81

二、不连续系统下层分离胶的聚合81

三、不连续系统中的上层浓缩胶和连续系统凝胶的聚合82

四、加样82

五、电泳82

六、染色和脱色82

七、干胶84

第四节 几种不同凝胶电泳系统及其应用84

一、Leammli系统84

二、大孔胶系统86

三、Tris-Tricine系统87

第五节 注意事项88

一、形成凝胶的试剂要有足够的纯度88

二、激活剂的用量89

三、温度的影响90

四、氧气的影响90

五、凝胶添加剂90

六、聚胶时间90

七、单体的浓度％T，％C90

八、操作注意点90

参考文献91

第七章 液相电泳92

第一节 毛细管电泳92

一、概况92

二、材料95

三、基本操作步骤96

四、毛细管电泳分离模式及应用97

五、注意事项104

六、结束语104

第二节 连续自由流电泳105

一、概况105

二、材料109

三、自由流电泳操作步骤110

四、分离模式111

五、自由流电泳的应用113

六、自由流电泳在微重力下的特点115

七、展望116

第三节 液相等电聚焦117

一、旋转式等电聚焦117

二、循环式等电聚焦119

三、制备型连续流等电聚焦122

参考文献123

第八章 高效液相色谱127

第一节 高效液相色谱的类型及分离原理127

第二节 高效液相色谱的装置131

一、输液系统131

二、进样系统132

三、分离系统132

四、检测系统136

第三节 各类高效液相色谱应用实例137

一、反相高效液相色谱137

二、高效离子交换色谱138

三、高效疏水作用色谱138

四、高效排阻色谱138

五、高效亲和色谱139

第四节 讨论140

参考文献142

第九章 质谱144

第一节 引言144

第二节 四极和离子阱质谱144

一、四极质谱仪（quadrupole mass spectrometry）144

二、四极离子阱质谱（quadrupole ion trap mass spectrometry）147

第三节 飞行时间质谱154

第四节 傅里叶转换回旋共振质谱160

一、基本原理160

二、质量分辨率、质量精度和质量范围163

参考文献165

第十章 毛细管电泳-质谱联用167

第一节 介绍167

一、概况167

二、CE/MS联用的接口169

三、其他联用方式172

四、CE/MS的限制性因素及其改进方法173

五、应用177

第二节 材料179

一、试剂和溶剂179

二、多肽和蛋白质180

三、酶180

四、仪器181

第三节 方法181

一、胰蛋白酶酶解181

二、血红蛋白的脱盐和纯化181

三、蛋白磷酸酶去磷酸化181

四、蛋白质二硫键的羧酰胺甲基化及产物的HPLC纯化和蛋白酶酶解182

五、N-糖苷酶F酶解182

六、α-甘露糖苷酶酶解182

七、正离子非共价涂层毛细管电泳182

八、毛细管电泳-质谱联用182

九、蛋白质序列数据库搜索183

十、特殊肽段的选择性离子监测184

十一、毛细管等电聚焦-质谱联用184

第四节 结果185

一、多肽和蛋白质的分析与鉴定185

二、蛋白质点突变的鉴定190

三、蛋白质磷酸化的鉴定193

四、蛋白质N-糖基化和氧化的鉴定194

五、蛋白质混合物的毛细管等电聚焦-质谱联用分析199

第五节 展望203

参考文献203

第十一章 毛细管电泳在蛋白质磷酸化和糖基化分析中的应用208

第一节 毛细管电泳分析多肽和蛋白质磷酸化208

一、简介208

二、材料209

三、方法209

四、结果和讨论210

第二节 毛细管电泳分析单糖和寡糖212

一、简介212

二、材料216

三、方法216

四、结果和讨论217

第三节 毛细管电泳分析糖蛋白微不均一性221

一、简介221

二、材料223

三、方法223

四、结果和讨论223

第四节 结语和展望225

参考文献226

下篇 蛋白质组学233

第十二章 导论233

一、蛋白质组学研究的历史和背景233

二、蛋白质组学的特点与难点234

三、蛋白质组学发展趋势239

参考文献240

第十三章 样品的全息制备242

第一节 双向凝胶电泳常规样品制备及其改进242

一、概述242

二、样品裂解液中各种成分分析243

三、双向凝胶电泳常规样品制备245

四、蛋白质顺序提取法245

五、注意事项246

第二节 培养细胞蛋白质样品的制备246

一、细胞破碎的处理方法246

二、培养细胞总蛋白质的提取247

第三节 组织样品制备249

一、概述249

二、动物组织样品的制备249

三、植物组织样品的制备260

四、注意事项261

第四节 分泌蛋白质样品的制备261

一、真核细胞的分泌蛋白质样品制备262

二、细菌分泌蛋白质样品制备263

第五节 体液蛋白质样品的制备263

一、血清蛋白质样品的制备263

二、脑脊液蛋白质样品的制备264

三、总结265

参考文献265

第十四章 双向凝胶电泳269

第一节 介绍269

一、双向凝胶电泳简介269

二、IPG-DALT双向凝胶电泳270

第二节 试剂、设备和溶液配制275

一、试剂275

二、仪器275

三、溶液配制276

第三节 实验操作277

一、样品制备277

二、蛋白质定量278

三、双向凝胶电泳279

第四节 胶上蛋白质的检测280

一、介绍280

二、染色方法283

参考文献286

第十五章 电泳图谱的图像分析290

第一节 介绍290

第二节 PDQuest软件简介290

第三节 PDQuest软件的使用291

一、材料291

二、方法292

第四节 双向凝胶电泳软件的实际应用299

一、双向凝胶电泳的重复性和定量定性差异分析299

二、双向凝胶电泳矢量图304

第五节 双向凝胶电泳数据库和网上比较305

一、双向凝胶电泳网络数据库资源305

二、双向凝胶电泳数据库的构建308

三、双向电泳凝胶的网上比较309

参考文献310

第十六章 生物质谱技术和蛋白质鉴定311

第一节 生物质谱基本原理和工作模式311

第二节 质谱法分析完整蛋白质和多肽316

第三节 质谱法对蛋白质和多肽一级结构的分析及鉴定317

一、质谱分析多肽序列的原理317

二、质谱法结合数据库检索对多肽和蛋白质进行鉴定318

三、多肽从头测序325

第四节 质谱前蛋白质或多肽样品制备方法和关键步骤328

参考文献335

第十七章 蛋白质组研究中的定量方法340

第一节 介绍340

一、概述340

二、化学标记定量方法341

第二节 材料346

一、试剂和溶剂346

二、多肽、蛋白质和细胞347

三、仪器347

第三节 方法347

第四节 结果和讨论349

第五节 展望356

参考文献356

第十八章 蛋白质组研究中的翻译后修饰分析358

第一节 磷酸化蛋白质组研究358

一、介绍358

二、材料369

三、方法370

四、结果371

五、展望372

第二节 糖基化蛋白质组研究374

一、介绍374

二、材料383

三、方法383

四、结果和讨论384

五、展望388

参考文献389

第十九章 亚细胞蛋白质组学394

第一节 概论394

一、亚细胞蛋白质组学内涵394

二、亚细胞蛋白质组学的意义395

三、亚细胞蛋白质组学的技术基础396

四、亚细胞蛋白质组学研究进展404

五、总结405

第二节 细胞膜的蛋白质组学研究进展406

一、细胞膜的结构与功能406

二、膜蛋白质的特点406

三、膜蛋白质的双向凝胶电泳技术研究407

四、膜蛋白质的非双向凝胶电泳技术研究408

五、总结408

第三节 高尔基体蛋白质组学研究进展408

一、高尔基体的结构和功能408

二、高尔基体的蛋白质组学研究409

三、蛋白质组学研究发现新的高尔基体蛋白质410

四、不同功能状态高尔基体的比较蛋白质组学研究410

五、总结411

第四节 核孔复合体蛋白质组学研究进展411

一、核孔复合体的结构和功能411

二、酵母核孔复合体蛋白质组学研究412

三、哺乳动物核孔复合体蛋白质组学研究413

四、总结413

第五节 核仁蛋白质组学研究进展414

一、核仁的结构与功能414

二、核仁的蛋白质组学研究进展415

三、总结415

第六节 线粒体蛋白质组学研究415

一、线粒体蛋白质组学研究进展416

二、材料420

三、方法421

四、结果422

第七节 展望422

参考文献424

第二十章 蛋白质组研究中的非凝胶技术432

第一节 概况432

第二节 非凝胶色谱技术433

一、一维色谱及其与质谱联用技术433

二、多维色谱及其与质谱联用技术435

第三节 非凝胶电泳439

一、液相等电聚焦439

二、毛细管电泳444

第四节 毛细管电色谱及其在蛋白质组学研究中的初步应用444

一、毛细管电色谱简介444

二、毛细管电色谱在蛋白质和多肽分离中的应用448

第五节 展望449

参考文献450

第二十一章 蛋白质相互作用和蛋白质芯片456

第一节 蛋白质相互作用456

一、概况456

二、蛋白质相互作用研究策略和方法457

三、结语467

第二节 蛋白质芯片467

一、蛋白质芯片的分类468

二、蛋白质芯片的检测方法471

三、蛋白质芯片技术的应用及发展前景472

参考文献473

第二十二章 蛋白质组生物信息学477

一、大规模蛋白质组学实验信息的产生477

二、将实验信息处理成具有生物学意义的实验结果477

三、对实验结果的分析491

四、实验室信息管理系统506

五、总结507

参考文献507

第二十三章 蛋白质组学在各领域的应用511

第一节 蛋白质组学在微生物研究中的应用511

一、概述511

二、蛋白质组学在模式微生物研究中的应用512

三、蛋白质组学在病原微生物研究中的应用515

四、展望521

第二节 蛋白质组学在肿瘤研究中的应用521

第三节 蛋白质组学在神经系统研究中的应用528

一、介绍528

二、应用举例529

第四节 蛋白质组学在体液研究中的应用534

一、介绍534

二、体液的蛋白质组学研究现状536

三、展望544

第五节 蛋白质组学在其他领域的应用545

一、蛋白质组学在植物研究中的应用545

二、蛋白质组学在药物开发方面的研究547

三、结语548

参考文献548

后记559