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1 基因工程概述1

1.1 基因工程概念1

1.1.1 基因工程的基本定义1

1.1.2 基因工程的基本原理和流程1

1.2 基因工程发展简史3

1.2.1 早期准备3

1.2.2 基因工程的诞生3

1.2.3 基因工程的成熟3

1.2.4 进入第二代基因工程3

1.3 基因工程技术研究的主要内容4

1.3.1 基因工程的基础性研究4

1.3.2 基因工程的应用性研究5

2 基因操作中的工具酶7

2.1 限制性内切酶7

2.1.1 限制性内切酶的识别序列7

2.1.2 限制性内切酶的命名8

2.1.3 限制性内切酶的酶切片断8

2.1.4 限制性内切酶的类型8

2.1.5 限制性内切酶的反应系统9

2.2 DNA聚合酶9

2.2.1 大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ9

2.2.2 DNA聚合酶Ⅰ的大片段（Klenow片段）10

2.2.3 T4噬菌体DNA聚合酶10

2.2.4 T7噬菌体DNA聚合酶11

2.2.5 热稳定的DNA聚合酶11

2.2.6 逆转录酶12

2.2.7 末端转移酶12

2.3 DNA连接酶13

2.3.1 T4 DNA连接酶13

2.3.2 大肠杆菌的DNA连接酶14

2.4 RNA聚合酶14

2.5 其他工具酶类15

2.5.1 碱性磷酸酶15

2.5.2 T4多核苷酸激酶15

2.5.3 核酸酶15

3 基因工程载体17

3.1 载体的基本要求和特性17

3.1.1 载体的基本要求17

3.1.2 载体具有与使用目的相一致的结构18

3.2 质粒载体18

3.2.1 质粒载体的生物学特性18

3.2.2 质粒载体构建的思路19

3.2.3 pBR322质粒载体21

3.2.4 pUC质粒载体21

3.2.5 pGEM系列载体质粒23

3.2.6 pBluescriptⅡKS24

3.3 λ噬菌体载体24

3.3.1 λ噬菌体的生物学特性24

3.3.2 λ噬菌体构建载体的依据26

3.3.3 构建λ噬菌体载体的基本策略26

3.3.4 λ噬菌体载体的举例28

3.3.5 λ噬菌体载体的应用32

3.4 M13噬菌体载体32

3.4.1 M13噬菌体与载体有关生物学特性32

3.4.2 构建M13载体32

3.4.3 噬菌粒载体33

3.4.4 M13载体的应用34

3.5 cosmid载体35

3.5.1 cosmid载体的概况35

3.5.2 cosmid载体的特性35

3.5.3 cosmid载体使用的基本程序36

3.6 酵母人工染色体36

3.7 细菌人工染色体37

3.8 哺乳动物细胞的载体38

3.8.1 SV40载体39

3.8.2 腺病毒载体40

3.8.3 痘苗病毒41

3.8.4 逆转录病毒载体41

4 核酸的分离纯化和制备43

4.1 质粒DNA的制备43

4.1.1 质粒DNA提取方法的选择43

4.1.2 质粒提取的共同步骤44

4.1.3 SDS碱裂解法小量制备质粒DNA44

4.1.4 SDS碱裂解法大量制备质粒DNA45

4.1.5 提取质粒DNA的其他方法46

4.1.6 质粒纯化的氯化铯-溴化乙锭梯度平衡超离心法46

4.1.7 DNA制备中几项常规操作47

4.2 λ噬菌体DNA的制备48

4.2.1 λ噬菌体颗粒的制备48

4.2.2 λ噬菌体DNA的制备48

4.3 真核基因组DNA的分离49

4.3.1 制备高分子量DNA的方法49

4.3.2 基因组DNA酶切片段化49

4.4 用于cDNA克隆的mRNA分离纯化50

4.4.1 细胞内mRNA丰度的差异50

4.4.2 制备mRNA之前需要考虑的问题50

4.4.3 真核细胞mRNA的提纯51

4.4.4 mRNA的检测52

4.4.5 mRNA的富集52

4.5 基因的化学合成和片段设计53

4.5.1 寡核苷酸化学合成的方法53

4.5.2 核苷酸单体修饰基团和固相载体54

4.5.3 寡聚核苷酸化学合成的基本步骤55

4.5.4 DNA大片段合成的策略56

4.5.5 DNA化学合成的应用57

4.6 聚合酶链式反应57

4.6.1 PCR反应的原理57

4.6.2 PCR反应过程57

4.6.3 PCR反应循环参数的设定58

4.6.4 耐高温的DNA聚合酶58

4.6.5 PCR的引物59

4.6.6 PCR的应用60

4.7 核酸的定量和检测61

4.7.1 DNA或RNA的分光光度法测定62

4.7.2 用Hoechst33258进行荧光测定62

4.7.3 用溴化乙锭定量测定双链DNA62

4.7.4 SYERGold染色62

4.8 凝胶电泳技术63

4.8.1 琼脂糖凝胶电泳的原理63

4.8.2 琼脂糖凝胶电泳的影响因素63

4.8.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳64

4.8.4 脉冲场凝胶电泳64

5 DNA克隆66

5.1 DNA克隆的策略和技术路线66

5.1.1 DNA克隆的概念66

5.1.2 DNA克隆的要素66

5.1.3 DNA克隆的技术路线67

5.2 目的基因的来源68

5.3 DNA分子片段化68

5.3.1 DNA分子经限制性内切酶酶切的末端结构68

5.3.2 确定单一酶切或双酶酶切69

5.3.3 DNA的部分酶切69

5.3.4 影响DNA片段化的反应条件69

5.3.5 DNA片段的回收70

5.4 DNA片段的体外重组71

5.4.1 DNA连接酶催化DNA的连接71

5.4.2 同源粘性末端之间的连接71

5.4.3 平头末端之间的连接72

5.4.4 定向重组和定向克隆72

5.4.5 DNA末端的修饰改造73

5.5 重组DNA导入受体细胞76

5.5.1 受体细胞76

5.5.2 重组DNA导入原核生物细胞77

5.5.3 重组λ噬菌体DNA转导大肠杆菌78

5.5.4 重组DNA导入哺乳动物细胞78

5.6 亚克隆技术79

6 DNA序列测定81

6.1 概述81

6.1.1 DNA测序的发展81

6.1.2 DNA测序的策略82

6.2 双脱氧末端终止法82

6.2.1 双脱氧末端终止法的原理82

6.2.2 双脱氧末端终止法的要素83

6.2.3 双脱氧末端终止法的试剂条件84

6.2.4 DNA测序的放射性标记85

6.2.5 双脱氧末端终止法测序的载体系统85

6.2.6 T7 DNA聚合酶进行双脱氧测序反应88

6.2.7 Taq酶进行双脱氧测序90

6.2.8 PCR进行双脱氧测序90

6.2.9 测序凝胶上分离DNA序列90

6.3 大规模DNA测序91

6.3.1 双脱氧末端终止法测定DNA序列方法的选择91

6.3.2 大片段的随机重叠DNA文库91

6.3.3 大片段测序的引物步移策略93

6.3.4 待测DNA大片段定向连续次级克隆94

6.4 DNA测序自动化和测序技术的发展95

6.4.1 DNA测序技术的进展95

6.4.2 基于凝胶电泳的两种测序系统96

6.4.3 荧光标记的两种方式96

6.4.4 其他测序方法97

7 DNA文库98

7.1 两类DNA文库98

7.1.1 DNA文库的概念98

7.1.2 基因组文库包含一种生物的全部遗传信息99

7.1.3 cDNA文库反映了特定细胞的转录组99

7.1.4 构建DNA文库的一般程序100

7.2 构建cDNA文库的常用方法100

7.2.1 polyA-mRNA逆转录合成单链cDNA100

7.2.2 运用不同引物合成cDNA第二链101

7.2.3 cDNA第二链的合成条件104

7.2.4 DNA的人工接头或插口104

7.2.5 cDNA克隆载体的比较105

7.2.6 cDNA与人工接头或插口的连接106

7.2.7 双链cDNA与λ噬菌体臂的连接和体外包装107

7.2.8 cDNA文库的改进107

7.3 基因组文库的概况108

7.3.1 构建基因组文库的基本步骤108

7.3.2 基因组文库的大小108

7.4 λ噬菌体载体构建真核基因组DNA文库的109

7.4.1 DNA片段的分离109

7.4.2 λ载体臂的制备109

7.4.3 基因组DNA片段与λ载体臂的连接110

7.4.4 基因组文库的扩增110

7.5 大容量载体构建基因组DNA文库111

7.5.1 cosmid构建基因组文库的优缺点111

7.5.2 cosmid质粒载体的制备112

7.5.3 真核DNA片段的制备113

7.5.4 cosmid载体与外源DNA片段的重组113

7.5.5 cosmid文库的有效性分析113

7.5.6 YAC文库的构建113

8 克隆筛选与检测116

8.1 重组克隆的初步筛选116

8.1.1 重组克隆的遗传学检测法116

8.1.2 报告基因技术的原理117

8.1.3 基因工程中常用的报告基因118

8.1.4 依赖于重组子结构特征分析的筛选方法119

8.2 目的克隆的鉴定120

8.2.1 分子杂交120

8.2.2 免疫学检测120

8.2.3 蛋白质活性和功能互补筛选120

8.3 核酸分子杂交探针的概述121

8.3.1 核酸探针的种类121

8.3.2 寡核苷酸探针的序列要求122

8.3.3 标记物的选择123

8.3.4 核酸探针标记的两种基本方法123

8.3.5 核酸探针的放射性标记123

8.3.6 探针比放射活性的测定129

8.3.7 非放射性探针标记方法129

8.3.8 非放射性探针显色反应的检测132

8.4 核酸分子杂交132

8.4.1 膜上印迹杂交133

8.4.2 Southern杂交133

8.4.3 Northern杂交135

8.4.4 其他杂交形式135

8.5 获得目的基因的一些基本技术136

8.5.1 根据特异蛋白质分离目的基因137

8.5.2 用同源序列和已知基因序列分离目的基因137

8.5.3 表达序列标签法分离目的基因137

8.5.4 差异杂交法139

8.5.5 cDNA扣除杂交和扣除文库140

8.5.6 mRNA差异显示法140

8.5.7 基因表达系列分析法142

8.5.8 抑制差减杂交143

8.5.9 DNA微阵列144

8.5.10 噬菌体显示145

8.5.11 酵母双杂合系统分析146

9 外源目的蛋白质表达及其筛选148

9.1 外源基因在E.coli中表达所必需的调控元件148

9.1.1 外源基因表达要求一个复杂的系统148

9.1.2 复制起始位点149

9.1.3 调控型启动子149

9.1.4 终止子150

9.1.5 翻译调控元件150

9.2 常见的E.coli表达载体的类型150

9.2.1 非融合型表达的载体150

9.2.2 分泌型表达载体151

9.2.3 融合蛋白型表达载体152

9.3 外源基因在大肠杆菌中表达形式152

9.3.1 包涵体蛋白153

9.3.2 融合蛋白153

9.3.3 分泌型外源蛋白153

9.4 外源基因在E.coli中的表达文库154

9.4.1 λ载体构建外源基因的表达文库155

9.4.2 受体菌155

9.5 表达型克隆的筛选155

9.5.1 筛选用的探针155

9.5.2 放射免疫学检测156

9.5.3 免疫荧光抗体法检测表达蛋白157

9.5.4 免疫沉淀法检测表达蛋白157

9.5.5 表达蛋白的Western印迹检测157

9.5.6 外源基因瞬间表达的检测158

9.5.7 通过双链DNA与表达产物相互作用来检测159

9.5.8 翻译筛选法159

9.5.9 利用蛋白质相互作用鉴定表达的cDNA克隆160

9.5.10 进一步确定cDNA表达克隆160

9.6 大肠杆菌表达系统161

9.6.1 利用lacZ的pET表达系统161

9.6.2 谷胱甘肽-S-转移酶融合蛋白表达系统163

9.6.3 用碱性磷酸酯酶启动子和信号序列表达分泌蛋白164

9.7 融合蛋白的分离和切割165

9.7.1 化学裂解法165

9.7.2 连接子设计有酶切位点和纯化序列166

9.7.3 在谷胱甘肽-S-转移酶下游的酶切166

9.7.4 麦芽糖结合融合蛋白的亲和层析分离167

9.7.5 固定化的Ni2+吸附层析纯化含寡组氨酸标签的蛋白质168

9.8 提高外源基因表达水平的措施169

9.8.1 提高翻译水平169

9.8.2 减轻宿主细胞的代谢负荷170

9.8.3 提高表达蛋白的稳定性170

9.9 包涵体重组蛋白的分离纯化171

9.9.1 包涵体内蛋白质的分离171

9.9.2 复性蛋白质的纯化171

9.10 真核细胞表达系统172

9.10.1 酿酒酵母表达系统172

9.10.2 巴斯德毕赤酵母表达系统173

9.10.3 昆虫细胞的杆状病毒表达系统174

9.10.4 哺乳动物细胞表达系统175

10 蛋白质工程原理178

10.1 蛋白质工程的基本概念178

10.1.1 蛋白质工程的定义178

10.1.2 蛋白质工程的特性178

10.1.3 蛋白质工程与相关领域的区别179

10.1.4 蛋白质工程的主要难点179

10.2 蛋白质工程设计原理180

10.2.1 蛋白质突变体设计的一般步骤180

10.2.2 蛋白质工程的流程180

10.3 寡核苷酸引物介导的位点特异性定向突变180

10.3.1 寡核苷酸引物介导的诱变181

10.3.2 寡核苷酸介导的突变分子的富集181

10.4 利用PCR产生定点突变182

10.4.1 在基因序列的3′端和5′端区域产生突变182

10.4.2 重叠延伸PCR182

10.4.3 重叠延伸PCR导入取代、插入或缺失突变183

10.5 基因片段取代突变183

10.6 基因的体外分子进化183

10.6.1 随机突变的盒式取代184

10.6.2 易错PCR185

10.6.3 基因DNA改组185

10.7 蛋白质工程的设计和应用186

10.7.1 蛋白质工程设计中一些重要的解决方案186

10.7.2 提高蛋白质的稳定性186

10.7.3 减少重组多肽的错误折叠188

10.7.4 改变酶或蛋白质的结合特性188

10.7.5 酶催化特异性的修饰189

10.7.6 改善酶的催化活性189

11 基因工程药物191

11.1 基因工程蛋白质药物191

11.1.1 重组人胰岛素191

11.1.2 重组人生长激素192

11.1.3 重组人干扰素192

11.1.4 人白细胞介素194

11.2 基因工程疫苗195

11.2.1 基因工程疫苗的原理195

11.2.2 重组乙肝疫苗195

11.2.3 疫苗载体196

11.3 基因工程抗体196

11.3.1 天然抗体的局限性和基因工程抗体的策略196

11.3.2 重组单克隆抗体197

11.3.3 抗体基因片段的组合文库197

11.3.4 人源性CDR序列重排建立免疫文库198

11.3.5 小分子抗体198

11.4 核酸类药物199

11.4.1 反义核酸药物200

11.4.2 RNA干扰200

主要参考书目202