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第1章 绪论1

1.1 引言1

1.2 蛋白质纯化方法2

1.2.1 蛋白质与小分子纯化方法的比较2

1.2.2 蛋白质常用纯化方法2

1.2.3 蛋白质的分离工艺过程5

1.2.4 纯化工艺设计基本原则7

1.2.5 蛋白质纯化常用仪器和试剂8

1.2.6 蛋白质纯化应注意的事项10

1.3 蛋白质样品制备技术11

1.3.1 原材料的选择11

1.3.2 原材料的破碎技术13

1.3.3 样品的提取14

1.3.4 样品的回收15

1.3.5 提取液的处理技术17

1.4 蛋白质的沉淀分离技术23

1.4.1 盐析法23

1.4.2 有机溶剂沉淀法28

1.4.3 其他沉淀法31

1.5 膜分离技术在蛋白质纯化中的应用32

1.5.1 概述32

1.5.2 膜分离技术的分离原理及膜产品种类33

1.5.3 膜技术生物分离中的应用35

参考文献38

第2章 色谱法分类及理论39

2.1 色谱分类及装置39

2.1.1 色谱分类方法39

2.1.2 经典柱液相色谱技术42

2.1.3 高效液相色谱技术45

2.1.4 工业制备液相色谱技术52

2.1.5 经典色谱、高效色谱、制备色谱三者间的关系56

2.2 固定相57

2.2.1 基质58

2.2.2 填料的形状、大小、孔径、结构及分布70

2.2.3 配基73

2.3 流动相74

2.3.1 对流动相的一般要求75

2.3.2 流动相的主要性质75

2.4 基本理论76

2.4.1 保留值76

2.4.2 柱效能指标78

2.4.3 分离效能总指标81

参考文献86

第3章 离子交换色谱88

3.1 引言88

3.2 离子交换作用89

3.2.1 溶液中蛋白质的带电状况89

3.2.2 离子交换92

3.3 离子交换色谱保留机理94

3.3.1 静电作用保留模型94

3.3.2 计量置换保留模型95

3.4 离子交换填料97

3.4.1 离子交换填料的结构与分类97

3.4.2 离子交换填料的种类99

3.5 离子交换色谱填料的合成108

3.5.1 硅胶基体离子交换填料的合成108

3.5.2 高分子聚合物基体离子交换填料的合成110

3.5.3 琼脂糖基体离子交换填料的合成111

3.5.4 交联葡聚糖基体离子交换填料的合成112

3.5.5 纤维素基体离子交换填料的合成113

3.6 离子交换填料的性能及检测114

3.6.1 外观114

3.6.2 粒径分布测定114

3.6.3 最大耐压和最大流速的测定115

3.6.4 交换容量的测定116

3.6.5 蛋白质吸附量的测定117

3.7 离子交换色谱条件的选择118

3.7.1 色谱填料的选择118

3.7.2 柱子的选择122

3.7.3 流动相选择122

3.7.4 洗脱模式127

3.7.5 其他色谱条件128

3.8 离子交换色谱的应用129

3.8.1 色谱技术129

3.8.2 硅胶基体离子交换色谱应用实例132

3.8.3 多糖基体离子交换色谱应用实例134

3.8.4 规模放大的色谱条件137

3.8.5 IEC在蛋白质折叠复性中的应用138

3.9 离子交换色谱中蛋白质的累加进样分离法139

3.9.1 离子交换色谱中蛋白质洗脱曲线有突跃139

3.9.2 离子交换色谱中蛋白质的累加进样分离法139

3.9.3 离子交换色谱中蛋白质的累加进样分离法浓集样品140

3.9.4 离子交换色谱中蛋白质的选择性保留分离法141

3.10 多模式离子交换色谱141

参考文献143

第4章 亲和色谱145

4.1 引言145

4.2 基本原理145

4.3 亲和色谱填料147

4.3.1 基体148

4.3.2 配体150

4.3.3 间隔臂153

4.4 亲和色谱填料的制备153

4.4.1 亲和色谱合成路线153

4.4.2 多糖基体亲和色谱填料的制备155

4.4.3 硅胶基体亲和色谱填料的制备171

4.4.4 亲和色谱填料的性能评价172

4.4.5 已商品化的多糖基体亲和色谱填料及中间体172

4.5 若干类型亲和色谱介绍174

4.5.1 固定金属离子亲和色谱175

4.5.2 染料亲和色谱180

4.5.3 凝集素亲和色谱186

4.5.4 生物专一性亲和色谱189

4.5.5 共价亲和色谱190

4.5.6 磁性亲和色谱193

4.6 亲和色谱操作技术197

4.6.1 样品制备197

4.6.2 装柱及平衡197

4.6.3 上样及洗涤198

4.6.4 洗脱198

4.6.5 再生199

4.6.6 柱子的保存200

4.7 亲和色谱的应用200

4.7.1 生物大分子分离纯化和分析中的应用200

4.7.2 临床检测和治疗中的应用204

4.7.3 活性细胞膜色谱的应用204

4.7.4 食品安全性检查和农药残留检测中的应用205

参考文献205

第5章 排阻色谱207

5.1 引言207

5.2 排阻色谱原理208

5.3 排阻色谱固定相210

5.3.1 排阻色谱柱的参数210

5.3.2 排阻色谱填料的要求及种类211

5.3.3 葡聚糖凝胶213

5.3.4 琼脂糖凝胶214

5.3.5 硅胶基体凝胶215

5.3.6 聚丙烯酰胺凝胶216

5.3.7 复合凝胶Sephacryl和Superdex217

5.3.8 有机高分子类凝胶219

5.4 排阻色谱条件219

5.4.1 柱子填料219

5.4.2 柱子尺寸221

5.4.3 洗脱模式及流动相221

5.4.4 流速222

5.4.5 上样量223

5.5 排阻色谱的一般操作223

5.5.1 排阻色谱凝胶的准备223

5.5.2 排阻色谱的操作224

5.6 排阻色谱的应用227

5.6.1 蛋白质等大分子的分离纯化227

5.6.2 大分子的脱盐和脱小分子物质229

5.6.3 分子量测定229

5.6.4 排阻色谱用于蛋白质复性231

5.6.5 缓冲溶液的交换233

5.6.6 浓缩蛋白质溶液233

5.6.7 用排阻色谱测定蛋白质的构象转化点233

参考文献234

第6章 反相色谱236

6.1 反相色谱保留机理236

6.1.1 疏溶剂化理论236

6.1.2 计量置换模型238

6.1.3 双保留机理239

6.2 反相色谱的固定相241

6.2.1 常用反相色谱的固定相241

6.2.2 反相色谱固定相的合成244

6.3 反相色谱流动相245

6.4 蛋白质反相色谱实验条件的选择246

6.4.1 蛋白质反相色谱的固定相及柱子选择246

6.4.2 蛋白质反相色谱的流动相选择247

6.4.3 蛋白质反相色谱的柱子温度对保留值的影响249

6.4.4 蛋白质反相色谱的洗脱方式249

6.4.5 上样量对保留值和分离度的影响250

6.4.6 检测251

6.5 反相色谱的应用251

6.5.1 蛋白质反相色谱中的突跃及累加进样251

6.5.2 反相色谱在蛋白质分离中的应用252

6.5.3 肽图及氨基酸序列分析&.253

6.5.4 酶活性测定255

6.5.5 HPRPC的高效分离255

6.5.6 蛋白质构象变化的研究255

6.5.7 蛋白质样品脱盐256

参考文献256

第7章 疏水作用色谱258

7.1 引言258

7.2 蛋白质的亲水性和疏水性基团258

7.3 疏水作用色谱保留机理259

7.3.1 疏溶剂化理论259

7.3.2 熵增原理260

7.3.3 计量置换模型260

7.3.4 溶质和配基之间的界面自由能变化决定洗脱和吸附261

7.4 疏水作用色谱填料261

7.4.1 疏水作用色谱填料的构成261

7.4.2 商品化疏水作用色谱填料263

7.5 疏水作用色谱填料的合成263

7.5.1 硅胶基体疏水作用色谱填料的合成263

7.5.2 多糖基体疏水作用色谱填料的合成265

7.6 疏水作用色谱填料的性能及检测267

7.6.1 外观267

7.6.2 粒径分布测定267

7.6.3 最大耐压和最大流速的测定267

7.6.4 蛋白质吸附量的测定267

7.6.5 配基密度的测定268

7.6.6 蛋白质活性回收率测定269

7.7 疏水作用色谱条件的选择及对分离的影响270

7.7.1 色谱填料的选择271

7.7.2 柱子的选择271

7.7.3 流动相的选择272

7.7.4 温度对色谱的影响274

7.7.5 洗脱模式274

7.7.6 疏水色谱与反相色谱的关联275

7.8 疏水作用色谱的应用278

7.8.1 疏水作用色谱技术278

7.8.2 疏水作用色谱的应用实例280

7.9 HIC中蛋白质的累加进样分离法284

参考文献286

第8章 新型色谱和其他分离技术简介288

8.1 扩张床吸附技术288

8.1.1 扩张床吸附技术简介288

8.1.2 扩张床吸附技术中使用的介质288

8.1.3 扩张床吸附技术中使用的柱子290

8.1.4 扩张床吸附技术的操作291

8.1.5 扩张床吸附技术的应用293

8.1.6 扩张床吸附技术的应用实例293

8.2 多维液相色谱294

8.2.1 多维液相色谱基本概念294

8.2.2 多维液相色谱的相关技术295

8.2.3 多维液相色谱的应用298

8.3 径向色谱299

8.3.1 径向色谱的原理299

8.3.2 径向色谱的特点300

8.3.3 径向色谱的应用300

8.4 膜色谱302

8.4.1 膜色谱的原理和特点302

8.4.2 膜色谱的介质及色谱柱302

8.4.3 膜色谱的应用305

8.5 灌注色谱307

8.5.1 灌注色谱法的产生307

8.5.2 灌注色谱法的原理及特点308

8.5.3 灌注色谱法的应用311

8.6 逆流色谱313

8.6.1 逆流色谱的发展与仪器313

8.6.2 逆流色谱的分离原理315

8.6.3 逆流色谱在蛋白质分离中的应用317

8.7 整体柱色谱技术319

8.7.1 整体柱色谱技术简介319

8.7.2 整体柱色谱的柱子320

8.7.3 整体柱色谱的应用322

参考文献324

第9章 制备液相色谱技术327

9.1 分离条件评估参数328

9.1.1 负载量329

9.1.2 制备色谱分离效果的评估330

9.2 制备色谱装备的相关技术330

9.2.1 制备色谱柱筛板及流动相出入口选择330

9.2.2 制备色谱柱的装填技术331

9.2.3 制备色谱中的污染问题333

9.2.4 进样334

9.2.5 检测器335

9.2.6 自动化系统335

9.2.7 几个典型的制备色谱系统335

9.3 最佳化纯化条件建立336

9.3.1 影响色谱柱最大负载量的因素337

9.3.2 提高工业制备色谱处理量的方法338

9.3.3 样品的负载与回收率纯度间的关系341

9.4 色谱技术之间的相容性选择原则342

9.4.1 不同纯化阶段色谱技术选用原则342

9.4.2 不同色谱技术的相容性343

9.4.3 不同纯化技术与蛋白质色谱纯化技术组合的要求344

9.5 短柱制备色谱技术345

9.6 蛋白质纯化的精品更精技术347

9.7 制备色谱在蛋白质纯化方面的应用348

9.7.1 色谱法分离血液制品348

9.7.2 胰岛素的制备色谱纯化351

9.7.3 疫苗的制备色谱纯化352

9.7.4 制备HPLC的应用355

参考文献356

第10章 蛋白质的保存技术358

10.1 影响蛋白质保存稳定的因素359

10.1.1 空气359

10.1.2 温度359

10.1.3 水分360

10.1.4 光线360

10.1.5 样品的pH360

10.1.6 时间360

10.1.7 蛋白质本身性质改变360

10.1.8 保护剂的作用360

10.2 蛋白质的保存方法361

10.2.1 低温保存362

10.2.2 在稳定pH下保存363

10.2.3 在高浓度下保存364

10.2.4 在保护剂存在下保存366

10.3 固态保存372

10.3.1 制成干粉或结晶372

10.3.2 制成水不溶酶373

10.3.3 蛋白质的玻璃化保存技术373

10.3.4 制成酶衍生物374

10.3.5 冷冻干燥374

10.4 冷冻干燥技术375

10.4.1 冷冻干燥的原理和作用375

10.4.2 实验室制备冻干品的简易方法376

10.4.3 工业生产的冷冻干燥系统377

10.4.4 冷冻干燥对蛋白质活性的影响380

10.4.5 保护剂的作用381

参考文献387

第11章 蛋白质样品鉴定技术388

11.1 蛋白质的定量388

11.1.1 蛋白质的HPLC法定量389

11.1.2 单波长紫外分光光度法定量390

11.1.3 多波长紫外分光光度法定量391

11.1.4 凯氏定氮法392

11.1.5 双缩脲法392

11.1.6 考马斯亮蓝染色法393

11.1.7 Lowry法394

11.1.8 二喹啉甲酸法394

11.1.9 由蛋白质总活性定量395

11.2 蛋白质纯度分析396

11.2.1 紫外光度法396

11.2.2 超速离心沉降法396

11.2.3 凝胶电泳法396

11.2.4 色谱法403

11.2.5 活性对照法403

11.2.6 等电聚焦403

11.2.7 其他检测法404

11.3 蛋白质的定性表征404

11.3.1 蛋白质定性的依据404

11.3.2 蛋白质的电泳定性及分子量测定405

11.3.3 蛋白质的色谱定性和分子量测定405

11.3.4 蛋白质的质谱405

11.3.5 蛋白质的氨基酸序列测定409

11.3.6 蛋白质的等电点测定410

11.3.7 蛋白质的肽谱411

11.3.8 蛋白质中糖含量分析412

11.3.9 蛋白质的生物活性测定415

参考文献416