最新分子生物学实验技术2025|PDF|Epub|mobi|kindle电子书版本百度云盘下载

最新分子生物学实验技术PDF格式电子书版下载

注意：本站所有压缩包均有解压码： 点击下载压缩包解压工具

前言1

第1章 DNA与蛋白质相互关系1

1.1 细胞核蛋白质的提取1

1.1.1 细胞核蛋白质的提取2

1.1.2 细胞核提取物的快速制备法3

1.2 凝胶滞后实验4

1.2.1 凝胶滞后实验6

1.2.2 超级凝胶电泳9

1.3 干扰实验9

1.3.1 甲基化干扰实验10

1.3.2 尿嘧啶干扰实验13

1.4 脱氧核糖核酸酶I足迹分析14

1.5 随机PCR17

1.5.1 寡核苷酸的设计与合成18

1.5.2 寡核苷酸的纯化18

1.5.3 探针标记19

1.5.4 凝胶滞后实验纯化探针19

1.5.5 特异结合序列的克隆与序列分析21

1.6 核酸-蛋白质杂交实验22

1.6.2 标记探针23

1.6.3 蛋白质变性、复性23

1.6.1 电泳及电转移23

1.6.4 杂交及放射自显影24

参考文献25

第2章 cDNA文库构建及目的基因的筛选26

2.1 cDNA第一条链的合成26

2.1.1 cDNA第一条链合成的策略26

2.1.2 cDNA第一条链合成的操作步骤27

2.2 cDNA第二条链的合成29

2.2.1 置换合成法30

2.2.2 PCR法32

2.3.1 加尾载体作引物引导cDNA合成--定向克隆37

2.3 cDNA克隆的其他策略37

2.3.2 Okayama-Berg克隆法--定向克隆38

2.3.3 末端加尾直接克隆--非定向克隆39

2.3.4 加接头直接克隆--非定向克隆(双链cDNA末端无酶切位点)39

2.3.5 加接头克隆--定向克隆(双链cDNA一端带酶切位点)39

2.3.6 加连接子克隆--非定向克隆(双链cDNA末端无酶切位点)40

2.3.7 加连接子克隆--定向克隆(双链cDNA一个末端带有酶切位点)40

2.3.8 PCR产物的直接克隆--非定向克隆40

2.3.9 PCR产物的黏端克隆法--定向克隆(两个PCR引物均带酶切位点)41

2.3.10 无连接酶克隆法41

2.4.1 根据遗传表型筛选43

2.4 重组子的筛选与鉴定43

2.5 构建cDNA文库新方法44

2.4.2 分析重组子结构特征的筛选法44

2.5.1 减数cDNA文库45

2.5.2 标准化cDNA文库45

2.6 mRNA差示显示技术46

2.6.1 基本原理和方法46

2.6.2 优化反应条件49

2.6.3 差异显示技术在生物医学中的应用50

2.6.4 差异显示技术存在的问题及改良措施51

2.6.6 差异显示技术的展望52

2.6.5 差异显示技术与相关方法的比较52

2.7 人类基因组计划及后基因组计划53

2.7.1 物理图谱的制作53

2.7.2 测序及寻找新的功能因子54

2.7.3 人类后基因组计划57

参考文献60

第3章 抗体工程62

3.1 基因工程抗体的免疫学基础62

3.1.1 免疫应答62

3.1.2 抗体的分子结构和功能63

3.1.3 抗体基因的DNA重排65

3.1.4 抗体库的产生67

3.1.5 抗原抗体的结合68

3.2 噬菌体表面表达技术与噬菌体抗体69

3.2.1 表达Fab段抗体的pComb3载体系统69

3.2.2 表达scFv单链抗体pHEN1和pCANTAB5E的载体系统71

3.2.3 抗体基因的大肠杆菌中的转录和翻译72

3.2.4 Fab抗体或scFv抗体在细胞膜间隙的组装72

3.3 基因工程重组抗体--Fab抗体73

3.3.1 淋巴细胞的分离纯化73

3.2.5 用于噬菌体抗体表达系统的大肠杆菌菌株73

3.3.2 总细胞RNA的提取74

3.3.3 cDNA的合成75

3.3.4 PCR扩增Fab抗体基因75

3.3.5 PCR产物的纯化78

3.3.6 Fd和轻链基因的克隆及噬菌体抗体库的建立79

3.3.7 噬菌体抗体库的富集筛选80

3.3.8 噬菌体抗体库的菌落筛选法81

3.3.9 Fab抗体在原核细胞中的可溶性表达82

3.3.10 电转感受态菌XIL-BIu的制备82

3.3.13 噬菌体毒种的滴定83

3.3.11 电转感受态菌TGI的制备83

3.3.12 辅助噬菌体毒种制备83

3.4 基因工程重组抗体--单链抗体scFv84

3.4.1 淋巴细胞的分离纯化84

3.4.2 总细胞RNA的提取和cDNA的合成84

3.4.3 PCR扩增抗体可变区基因及scFv单链抗体基因84

3.4.4 Linker连接片段的制备89

3.4.5 人单链Fv(seFv)片段的组装89

3.4.6 seFv单链噬菌体抗体库的构建90

3.4.7 单链噬菌体抗体库的富集筛选91

3.4.8 seFv单链抗体融合表达和可溶性表达92

3.5.1 抗Fab抗体亲和层析纯化法93

3.5 Fab段抗体和scFv单链抗体表达产物的纯化和鉴定93

3.5.2 Protein A·Sepharose柱层析纯化94

3.5.3 金属离子亲和层析柱纯化94

3.5.4 Fab抗体或scFv抗体的特异性鉴定95

3.5.5 重组抗体可变区基因序列测定及分析95

3.6 重组抗体全免疫球蛋白基因的表达96

3.6.1 可变区基因与恒定区基因的连接--全抗体基因在哺乳类细胞中的表达96

3.6.2 全IgG抗体基因的表达系统--重组杆状病毒系统97

参考文献100

4.1.1 丝状噬菌体的基本特征101

第4章 丝状噬菌体表面显示技术的基本原理和应用101

4.1 概述101

4.1.2 噬菌体显示的基本原理和优势103

4.1.3 噬菌体显示技术的发展和意义103

4.1.4 噬菌体显示的基本策略104

4.2 噬菌体随机多肽文库104

4.2.1 概述104

4.2.2 构建噬菌体肽库的操作步骤110

4.3 噬菌体在cDNA文库表达和筛选中的应用115

4.3.2 pJuFo载体应用举例117

4.3.1 pJuFo载体的概述117

4.3.3 pJuFo系统的筛选119

4.3.4 pJuFo系统的应用119

4.3.5 pJuFo系统优势和限制因素119

4.4 噬菌体在蛋白质改造中的应用120

4.4.1 选择突变蛋白质的一般原则120

4.4.2 实验设计的一般步骤和程序121

4.5 影响噬菌体筛选效率的因素124

4.5.1 表达水平对筛选效率的影响124

4.5.2 亲和力对筛选效率的影响124

4.6.1 噬菌体肽库和抗体库125

4.6 噬菌体表面显示技术相关的信息资源125

4.6.2 抗噬菌体抗体126

4.6.3 如何分析筛选结果126

4.6.4 分子文库的WWW网址126

参考文献126

第5章 聚合酶链反应129

5.1 基本PCR技术129

5.1.1 基本步骤130

5.1.2 实验条件的优化131

5.2.1 基本步骤133

5.2 RT-PCR133

5.2.2 简化步骤135

5.2.3 影响因素135

5.3 单侧(锚式)PCR136

5.3.1 扩增已知序列的下游片段136

5.3.2 扩增已知序列的上游片段137

5.3.3 注意事项139

5.4 差异显示PCR140

5.4.1 实验步骤141

5.4.2 注意事项143

5.5 免疫PCR144

5.5.1 实验步骤145

5.6 PCR-ELISA147

5.5.2 注意事项147

5.6.1 实验步骤148

5.6.2 注意事项148

参考文献148

第6章 实用DNA突变技术150

6.1 无表型选择的寡核苷酸介导的突变151

6.1.1 突变原理151

6.1.2 实验操作步骤152

6.2.1 突变原理154

6.1.3 注意事项154

6.2 简并寡核苷酸诱变154

6.2.2 实验操作步骤156

6.2.3 注意事项157

6.3 基因人工合成157

6.3.1 突变原理157

6.3.2 实验操作步骤158

6.3.3 注意事项159

6.4 区域特异性突变159

6.4.1 突变原理159

6.4.2 实验操作步骤161

6.4.3 注意事项162

6.5 DNA的接头分区突变163

6.5.1 突变原理163

6.5.2 使用巢式缺失的互补寡核苷酸的接头分区突变(基本方案)164

6.5.3 使用寡核苷酸定位的接头分区突变(替代方案)166

6.5.4 注意事项166

6.6 PCR介导的突变166

6.6.1 通过PCR方法引入限制性酶切位点原理(基本方案1)167

6.6.2 实验操作步骤168

6.6.4 实验操作步骤169

6.6.3 通过PCR方法引入点突变原理(基本方案2)169

6.6.5 通过连续PCR引入点突变原理(替代方案)170

6.6.6 实验操作步骤170

6.6.7 注意事项172

参考文献172

第7章 外源基因在哺乳动物细胞中的表达174

7.1 外源基因导入哺乳动物细胞中的技术方法174

7.1.1 磷酸钙沉淀转染法175

7.1.2 DEAE-葡聚糖转染法177

7.1.3 脂质体介导的转染180

7.1.4 电穿孔转染法181

7.1.5 基因枪粒子轰击法183

7.1.6 受体介导的基因导入法184

7.2 病毒载体介导的基因转移186

7.2.1 通过反转录病毒系统表达外源基因的原理187

7.2.2 建立特异的产反转录病毒细胞系(基本方法)189

7.2.3 通过腺病毒载体系统表达外源基因194

7.3 报告基因的表达及检测195

7.3.1 半乳糖苷酶基因197

7.3.2 氯霉素乙酰转移酶基因198

7.3.3 荧光素酶基因200

7.3.4 绿色荧光蛋白基因201

7.3.5 人生长激素基因202

7.3.6 分泌型的碱性磷酸酶基因203

7.3.7 β-葡萄糖醛酸酶基因203

7.4 外源基因的稳定表达203

7.4.1 保留稳定转化细胞系的常用选择标记204

7.4.2 分离稳定转化细胞系的基本步骤(基本方法)205

参考文献206

8.1 DNA测序方法概述208

8.1.1 DNA测序方法的分类208

第8章 DNA 序列测定208

8.1.2 DNA测序的策略211

8.1.3 双脱氧测序法和化学测序法的选择216

8.1.4 DNA测序技术的进展216

8.2 构建DNA测序用的嵌套缺失218

8.2.1 用外切酶Ⅲ(ExoⅢ)构建单一方向的缺失(基本操作)219

8.2.2 用［a-35S］dNTPs保护DNA使其免受外切酶Ⅲ(ExoⅢ)的消化222

8.2.3 用Bal31核酸酶构建嵌套缺失(基本操作)223

8.2.4 制备M13mp测序载体来亚克隆Bal31消化的DNA片段228

8.2.5 注释229

8.3 DNA序列测定模板的制备230

8.3.1 单链M13噬菌体DNA的制备231

8.3.2 从小量细胞裂解液中制备λDNA模板233

8.3.3 化学测序所需重组pSP64CS或pSP65CS质粒DNA的微量制备234

8.3.4 双脱氧法测序所需双链质粒DNA的微量制备234

8.3.5 双脱氧法测序所需双链质粒DNA的碱变性235

8.3.6 从一个大肠杆菌菌落中制备质粒DNA或从一个噬菌斑中制备噬菌体DNA用于热循环测序236

8.3.7 注释236

8.4 DNA双脱氧测序法237

8.4.1 用测序酶(Sequenase)来标记/终止测序反应(基本操作)242

8.4.3 在标记/终止测序反应中使用其他DNA聚合酶(替代操作2)244

8.4.2 在标记/终止反应中使用Mn2+离子(替代操作1)244

8.4.4 Klenow片段进行Sanger法测序(基本操作)245

8.4.5 利用Taq DNA聚合酶Sanger反应(替代操作)245

8.4.6 利用5＇末端标记引物进行一步法测序(替代操作2)246

8.4.7 利用同位素标记核苷酸进行热循环测序反应(基本操作))247

8.4.8 利用5＇端引物标记进行热循环测序反应(替代操作)248

8.4.9 注释249

8.5 用化学发光检测法进行DNA双脱氧测序258

8.5.1 用生物素化引物进行化学发光检测的DNA测序(基本操作)261

8.5.3 用半抗原标记引物进行测序，用抗体-碱性磷酸酶偶联物进行检测(替代操作2)263

8.5.2 用链霉抗生物素蛋白和生物素化碱性磷酸酶进行两步(间接)检测(替代操作1)263

8.5.4 注释264

8.6 化学法测定DNA序列267

8.6.1 策略设计267

8.6.2 用32P标记DNA的化学测序(基本操作)268

8.6.3 Tth1111消化和末端标记(替代操作)271

8.6.4 注释272

8.7 变性凝胶测定电泳272

8.7.1 灌胶、电泳和测序凝胶的处理(基本操作)274

8.7.2 缓冲液梯度测序凝胶(替代操作1)276

8.7.3 电解质梯度测序凝胶(替代操作2)276

8.7.5 注释277

8.7.4 含甲酰胺的测序凝胶(替代操作3)277

参考文献278

第9章 蛋白质的表达280

9.1 外源基因在原核细胞中的表达280

9.1.1 蛋白质在原核细胞中的表达特点280

9.1.2 蛋白质在原核细胞表达的调控281

9.1.3 蛋白质在原核细胞中的表达形式281

9.1.4 T7启动子的原核表达系统282

9.1.5 利用pET载体在大肠杆菌中表达外源基因的基本操作283

9.2 外源基因在哺乳动物细胞内的表达287

9.2.1 病毒介导的基因表达288

9.2.2 重组痘苗病毒共表达汉坦病毒M和S片断的操作步骤289

9.2.3 外源基因在哺乳动物细胞中的瞬时表达295

9.2.4 痘苗病毒瞬时表达T7RNA聚合酶的操作步骤296

9.2.5 外源基因在哺乳动物细胞系中的稳定表达297

9.2.6 哺乳动物细胞系稳定表达汉坦病毒S片断的操作步骤299

9.3 外源基因在杆状病毒系统的表达303

9.3.1 杆状病毒系统表达外源基因的特点和策略303

9.3.2 杆状病毒表达汉坦病毒M片断的操作步骤306

9.4.1 免疫荧光(IFA)的原理和基本操作310

9.4 重组蛋白的检测和鉴定310

9.4.2 酶联免疫吸附试验312

9.4.3 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本操作313

9.4.4 蛋白印迹试验的基本操作315

9.4.5 放射免疫沉淀的原理和基本操作316

参考文献317

第10章 蛋白质与蛋白质相互作用的研究策略318

10.1 蛋白质间相互作用的形式和作用力318

10.1.1 蛋白质间相互作用的形式318

10.1.2 蛋白质之间相互作用的作用力319

10.2.1 蛋白质配体结合结构域的筛选320

10.2 蛋白质间相互作用的研究策略320

10.2.2 蛋白质配体的筛选323

10.3 酵母双杂交系统的操作程序327

10.3.1 酵母双杂交系统操作的基本流程327

10.3.2 实验材料327

10.3.3 基本实验方法330

10.4 注释334

参考文献334

第11章 生物芯片技术336

11.1 生物芯片技术的发展336

11.2.1 基因芯片337

11.2 生物芯片的类型337

11.2.2 蛋白芯片339

11.2.3 缩微芯片340

11.3 生物芯片应用的大致操作流程342

11.3.1 探针的设计、合成与芯片的制作342

11.3.2 靶基因样品的制备344

11.3.3 杂交344

11.3.4 杂交信号的检测与结果的分析345

11.4 生物芯片应用的具体操作方法346

11.4.1 cDNA微点阵346

11.4.2 寡核苷酸微点阵349

11.5 生物芯片技术的应用350

11.5.1 利用DNA芯片进行DNA序列的测定350

11.5.2 利用芯片技术进行基因突变的检测351

11.5.3 用于基因转录水平的监测、基因组分析和后基因组研究352

11.6 前景与展望354

参考文献355

第12章 生物信息学357

12.1 概述357

12.2 生物信息数据库与查询359

12.2.1 基因和基因组数据库359

12.2.2 蛋白质数据库361

12.2.3 功能数据库363

12.2.4 其他数据库资源364

12.3 序列比对和数据库搜索364

12.3.1 序列两两比对365

12.3.2 多序列比对368

12.4 核酸与蛋白质结构和功能的预测分析368

12.4.1 针对核酸序列的预测方法369

12.4.2 针对蛋白质的预测方法371

12.5 分子进化373

12.5.1 分子进化钟与中性理论373

12.5.2 进化树374

12.6 基因组序列信息分析378

12.6.1 基因组序列分析工具378

12.6.2 人类和鼠类公共物理图谱数据库的使用379

12.6.3 基因组比较382

12.6.4 SNP预测382

12.7 功能基因组相关信息分析383

12.7.1 大规模基因表达谱分析383

12.7.2 基因组水平蛋白质功能综合预测389

参考文献390

附录1 实验室细胞培养的若干问题392

附录2 常用溶液与配制399