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第1章 冰冻显微免疫细胞化学的发展和应用1

1.1 历史简述和技术发展1

1.2 标记方法的选择3

1.3 显微免疫细胞化学在分子生物学和医学研究的应用7

1.3.1 在细胞分子生物学中的应用7

1.3.2 在病理学和肿瘤诊断中的应用9

第2章 冰冻切片和光学显微镜的免疫细胞化学12

2.1 免疫标记的基本原理12

2.1.1 抗体的种类12

2.1.2 抗体的结构13

2.1.3 抗原定位标记物13

2.1.4 抗体的标记方式17

2.1.5 抗体对不同抗原的双重或多重标记20

2.2 抗体特异性测定和实验对照20

2.2.1 测定新的第一抗体20

2.2.2 抗体所引起的非特异性染色21

2.2.3 防止非特异性标记的方法21

2.3 生物样品的处理和冰冻切片22

2.3.1 大组织块的冰冻切片方法22

2.3.2 冰冻半薄切片方法25

2.4 免疫荧光标记30

2.4.1 抗体和标记方法的选择30

2.4.2 荧光染料的特性和选择31

2.4.3 双重或多重荧光标记33

2.4.4 标记的步骤33

2.5 免疫过氧化物酶显色标记34

2.5.1 抗生物素蛋白-生物素方法35

2.5.2 快速临床免疫组织化学染色方法38

2.6 免疫标记出现问题的处理39

2.7 免疫标记实例42

2.7.1 老鼠胆管纤毛的冰冻半薄切片荧光标记42

2.7.2 用荧光和冰冻超薄切片对人胎盘抗原定位43

2.7.3 快速免疫组织化学染色44

第3章 冰冻超薄切片和电子显微镜的免疫金标记46

3.1 引言46

3.2 设备和试剂的准备47

3.2.1 冰冻切片机47

3.2.2 切片刀47

3.2.3 支持膜制作和碳覆盖48

3.2.4 免疫金粒标记物的制备49

3.3 生物样品的固定和处理方法54

3.3.1 固定剂54

3.3.2 其他影响固定质量的条件55

3.3.3 固定程序56

3.3.4 样品包埋处理58

3.3.5 蔗糖冰冻保护59

3.3.6 样品的安放和冰冻59

3.4 冰冻超薄切片60

3.4.1 样品的初修整和半薄切片60

3.4.2 样品块的细修整61

3.4.3 冰冻超薄切片61

3.4.4 切片的收集62

3.4.5 冰冻切片的保存62

3.5 免疫标记63

3.5.1 标记方法和程序63

3.5.2 蛋白A法64

3.5.3 IgG法67

3.6 图像的分析和问题处理67

3.7 应用实例71

3.7.1 蛋白A标记的应用例子71

3.7.2 IgG方法的应用例子71

第4章 快速冰冻固定方法72

4.1 引言72

4.2 冰冻固定的原理73

4.3 冰冻保护剂76

4.3.1 渗透性冰冻保护剂77

4.3.2 非渗透性冰冻保护剂77

4.4 冰冻固定的主要方法78

4.4.1 插入式冰冻方法79

4.4.2 冷金属块撞击式冰冻固定85

4.4.3 丙烷喷射冰冻固定89

4.4.4 喷洒式冰冻固定92

4.4.5 高压冰冻固定95

第5章 高压冰冻固定98

5.1 高压冰冻固定的基本原理98

5.2 样品处理和装放的关键步骤100

5.2.1 样品载体100

5.2.2 载体内细胞和组织的填充剂103

5.2.3 冰冻保护剂104

5.2.4 样品的装放104

5.3 冰冻样品的处理109

5.4 常规化学固定和高压冰冻固定效果的比较111

5.4.1 化学固定和高压冰冻固定的比较111

5.4.2 高压冰冻固定的局限性113

5.5 冰冻固定过程中出现的问题和解决方法114

5.5.1 高压冰冻固定的注意事项114

5.5.2 冰冻固定过程中出现的问题和解决方法114

第6章 冰冻置换116

6.1 概述116

6.2 冰冻置换的条件118

6.2.1 冰冻置换的温度和材料的准备118

6.2.2 冰冻置换的有机溶剂的选择和评估119

6.2.3 冰冻置换装置120

6.3 冰冻置换方法121

6.3.1 加入固定剂的冰冻置换121

6.3.2 免疫标记的冰冻置换123

6.3.3 冰冻置换的各种使用方法124

第7章 低温包埋和免疫标记129

7.1 渐进低温脱水和丙烯树脂包埋129

7.1.1 温度调整的方法和脱水溶剂129

7.1.2 丙烯树脂的特点和Lowicryl的配方130

7.1.3 渐进低温脱水方法131

7.1.4 低温渗透132

7.1.5 低温包埋134

7.1.6 树脂聚合134

7.1.7 Lowicryl树脂包埋块的切片136

7.2 LR White和LR Gold树脂包埋137

7.2.1 LR White树脂的准备和包埋137

7.2.2 LR Gold树脂的包埋139

7.3 免疫标记141

7.3.1 免疫标记的准备和应注意的问题141

7.3.2 丙烯酸树脂切片的免疫标记步骤141

7.3.3 后包埋免疫标记法142

7.4 免疫标记信号增强法144

7.4.1 纳米金-银染信号增强法144

7.4.2 胶体金／抗生物素法145

7.4.3 生物素-抗生物素金技术147

7.4.4 生物素化酪胺和纳米金银染法148

7.5 免疫标记中可能遇到的问题和处理方法149

7.6 应用实例151

7.6.1 动物单层细胞的后包埋免疫标记151

7.6.2 植物细胞的低温包埋和免疫标记152

7.6.3 大鼠胰腺和肝组织的免疫电镜标记——生物素-酪胺增强法153

第8章 前包埋免疫电镜技术156

8.1 细胞和组织标记前的处理156

8.2 抗体标记157

8.3 前包埋免疫标记应用实例160

8.3.1 过氧化物酶标记单层培养细胞抗原160

8.3.2 纳米金前包埋免疫电镜161

8.3.3 前包埋纳米金-银染和酪胺扩增法162

8.4 前包埋免疫双标记163

第9章 荧光显微镜和免疫电镜的对应定位技术166

9.1 概述166

9.2 突变细胞荧光活体和超微结构对应定位技术167

9.2.1 活体突变细胞定位168

9.2.2 电镜样品的处理和细胞定位169

9.3 荧光纳米金在荧光和免疫金标记的对应定位171

9.3.1 荧光纳米金探针的结构和特性172

9.3.2 荧光纳米金标记方法173

9.4 冰冻超薄切片的对应免疫荧光光镜和电镜174

9.5 量子点的光电镜对应定位177

9.5.1 量子点作为免疫细胞学标记物的主要特点177

9.5.2 量子点标记应用实例178

9.6 荧光蛋白的对应光电镜定位179

9.6.1 细胞荧光蛋白表达的光电镜对应标记方法180

9.6.2 绿荧光蛋白光氧化的对应荧光和电镜方法183

第10章 冰冻断裂复型的免疫电镜185

10.1 概述185

10.2 冰冻断裂和刻蚀189

10.2.1 样品的准备189

10.2.2 冰冻保护——甘油渗透方法192

10.2.3 冷冻处理192

10.2.4 冰冻断裂193

10.2.5 冰冻刻蚀194

10.2.6 复型195

10.2.7 复型膜的收集和清理196

10.3 复型膜面的免疫标记197

10.3.1 常规的标记步骤197

10.3.2 冰冻、断裂和复型前标记197

10.3.3 冰冻断裂后标记200

10.3.4 断裂和复型后的标记202

10.3.5 复型-标记-切片和复型-标记-整体装放204

10.4 应用实例206

10.4.1 用SDS消化冰冻断裂复型和细胞化学标记膜间蛋白——免疫金标记胞间连接复合物206

10.4.2 用SDS消化冰冻断裂复型标记螺旋菌壁黏附素的新方法208

第11章 负染色和免疫金标记技术209

11.1 概述209

11.2 负染色技术211

11.2.1 负染色的材料和准备211

11.2.2 负染色方法213

11.3 负染色免疫电镜方法214

11.3.1 负染色免疫电镜常规步骤214

11.3.2 负染色免疫电镜应用实例216

11.4 冰冻负染色方法217

11.4.1 材料准备217

11.4.2 非染色冰冻样品的制作步骤220

11.4.3 薄膜玻璃化负染色样品的制作221

11.5 负染色需要注意的问题223

附录Ⅰ225

附录Ⅱ 部分冰冻固定、免疫标记和抗体制作技术网址228

参考文献230