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第1章 RNA纳米技术方法综述——RNA纳米颗粒的合成、纯化及特性1

1 RNA纳米技术的定义1

2 构建多功能RNA纳米颗粒2

2.1 纳米颗粒的RNA支架组装4

2.2 合并功能模块为RNA纳米颗粒7

3 多功能RNA纳米颗粒的纯化和特征11

3.1 凝胶移位分析11

3.2 超速离心法11

3.3 高效液相色谱法12

3.4 RNA纳米颗粒的结构特征12

3.5 RNA纳米颗粒的功能试验13

4 展望13

5 结论14

致谢14

参考文献14

第2章 调查细菌小调控RNA自我组装的多种方法19

1 引言19

2 材料23

2.1 试剂23

2.2 缓冲液和溶液23

3 方法24

3.1 用于聚合作用研究的小非编码RNA（sRNA）的体外转录24

3.2 电泳分析sRNA的自组装25

3.3 二级结构预测和sRNA自组装最小序列的特征25

3.4 热变性分析26

3.5 利用近红外光谱分析碱基配对28

3.6 sRNA组装的分子成像30

3.7 粗提物中sRNA聚合物的检测33

3.8 非编码sRNA的RT-PCR定量分析34

3.9 结论35

4 注释36

致谢36

参考文献36

第3章 使用AFM测量包含核糖核苷酸的DNA分子的弹性40

1 引言40

2 材料42

2.1 寡核苷酸42

2.2 寡核苷酸上硫醇基的去保护43

2.3 原子力显微镜底衬的制备43

2.4 制备镀金的羧基修饰的氮化硅悬臂43

2.5 在金表面固定DNA底衬43

2.6 原子力显微镜液体电池44

2.7 原子力显微镜和配件44

3 方法44

3.1 制备含核糖核苷一磷酸的DNA寡核苷酸44

3.2 制备双链嵌入式-核糖核苷一磷酸DNA基质45

3.3 制备镀金羧基修饰氮化硅悬臂及含核糖核苷一磷酸的DNA基质的固定化45

3.4 用于测量力的原子力显微镜的校准46

3.5 原子力显微镜液体电池的清洁47

3.6 利用原子力显微镜力光谱测量双链含核糖核苷一磷酸的DNA的弹性47

3.7 数据分析48

4 注释50

致谢51

参考文献51

第4章 RNA纳米技术之银纳米簇：RNA纳米颗粒组装的观察以及跟踪的步骤55

1 引言55

2 材料56

2.1 转录和RNA纳米颗粒组装成分56

2.2 Ag:RNA成分57

3 方法57

3.1 RNA合成57

3.2 RNA纳米立方体的组装57

3.3 RNA组装的天然聚丙烯酰胺凝胶电泳实验58

3.4 合成Ag:RNA58

3.5 Ag:RNA光学测量58

4 注释59

致谢60

参考文献61

第5章 利用制备性超速离心大规模纯化RNA纳米颗粒63

1 引言63

2 材料67

2.1 梯度准备67

2.2 超速离心68

2.3 分馏和样品分析68

3 方法69

3.1 CsCl平衡密度法纯化RNA69

3.2 速率区带蔗糖梯度法分离纳米颗粒70

3.3 分馏和样品分析／回收（CsCl和蔗糖的相同）72

3.4 预期结果73

4 注释73

致谢75

参考文献75

第6章 HPLC纯化长达59个核苷酸具有单核苷酸分辨率的RNA适配体78

1 引言78

2 材料80

2.1 RNA样品80

2.2 HPLC仪器81

2.3 试剂和缓冲液81

3 方法81

3.1 配制缓冲液81

3.2 初始化和平衡柱子81

3.3 上样82

3.4 再平衡柱子83

3.5 样品处理83

4 注释83

参考文献87

第7章 在原核和真核细胞中利用具有热力学稳定基序和荧光模块的RNA纳米颗粒实时检测RNA的折叠和翻转89

1 引言89

2 材料91

2.1 体外转录和纯化RNA91

2.2 在E.coli中表达RNA92

2.3 体外和体内MG/DFHBI结合分析93

2.4 动物及人类细胞中RNA表达、折叠和降解的荧光成像93

3 方法94

3.1 融合RNA纳米颗粒的设计94

3.2 通过T7 RNA聚合酶体外转录制备RNA纳米颗粒并用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化RNA95

3.3 利用细菌表达、装配和纯化RNA纳米颗粒95

3.4 通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳体外评估RNA折叠96

3.5 通过MG分析，体外评估RNA的折叠98

3.6 通过DHBFI结合分析，体外评估RNA折叠98

3.7 体外监测RNA降解98

3.8 细菌体内RNA折叠的评估98

3.9 真核细胞中RNA折叠的评估99

3.10 在动物和人类细胞中实时检测RNA纳米颗粒半衰期100

4 注释101

致谢103

参考文献103

第8章 小RNA 3′端氧化的荧光标记105

1 引言105

2 材料106

2.1 体外转录组分106

2.2 标记组分107

2.3 凝胶阻滞成分107

3 方法107

3.1 体外转录107

3.2 RNA标记108

3.3 凝胶阻滞分析109

4 注释109

致谢110

参考文献111

第9章 RNA纳米颗粒对转移性肿瘤靶向定位及给药的方法和分析112

1 引言112

2 材料113

2.1 试剂114

2.2 设备115

2.3 试剂配制（见注释1）116

3 方法117

3.1 三叉接口（3WJ）自我装配117

3.2 通过激光共聚焦显微镜试验pRNA-3WJ纳米颗粒的细胞结合和内化118

3.3 通过流式细胞仪（FACS）实验检测pRNA-3WJ纳米颗粒的细胞结合（可选）118

3.4 为了产生小鼠皮下移植瘤，皮下注射肿瘤细胞（图9-3）119

3.5 为了产生转移瘤小鼠模型，在脾内注射肿瘤细胞119

3.6 靶肿瘤细胞中荧光RNA纳米颗粒的IVIS光谱在体成像（见注释13）120

3.7 靶标肿瘤组织中RNA荧光纳米颗粒的微观成像122

3.8 用流式细胞仪分析新鲜组织（可选）122

4 注释123

致谢124

参考文献124

第10章 RNA纳米颗粒在脑瘤中靶向给药的功能性试验127

1 引言127

2 材料128

2.1 材料128

2.2 设备129

2.3 试剂配制130

3 方法131

3.1 体内合成RNA以及构建RNA纳米颗粒131

3.2 用原子力显微镜成像显示RNA纳米颗粒的结构131

3.3 流式细胞仪分析体外检测叶酸介导的人脑瘤细胞定位（图10-2）133

3.4 荧光共聚焦显微镜体外检测叶酸介导的人癌细胞定位（图10-3）134

3.5 向小鼠模型系统中移植脑瘤（图10-4）135

3.6 利用核磁共振成像（MRI）对小鼠植入脑瘤的定位并测量大小（图10-4）135

3.7 患有脑瘤小鼠的间接体内荧光成像（图10-5）136

3.8 siRNA给药后体内生物荧光全身成像检测脑瘤（图10-6）137

4 注释138

致谢140

参考文献140

第11章 适配体介导的纳米颗粒相互作用：从寡核苷酸-蛋白质复合体到SELEX筛选142

1 引言142

2 材料144

2.1 流感病毒基质蛋白-1144

2.2 寡聚核苷酸合成和纯化144

2.3 自动化的SELEX145

2.4 RNA候选的自动化合成145

2.5 AlphaScreen？试验145

3 方法146

3.1 SELEX146

3.2 C6（36）适配体的特性：AlphaScreen？的M1复合体146

3.3 C1（36）-M1分析149

3.4 C1（36）-M1-C6（36）夹心试验149

3.5 HAPIscreen151

4 注释154

致谢154

参考文献154

第12章 通过黏性桥组合特异性的适配体-siRNA纳米颗粒的方法内化B细胞淋巴瘤157

1 引言157

2 材料159

2.1 细胞系159

2.2 通过体外转录合成BAFF-R R-1和HIV-1 gp120 A-1对照适配体160

2.3 适配体-黏性-siRNA纳米颗粒的结构161

2.4 通过凝胶迁移试验确定分离常数161

2.5 通过激光共聚焦显微镜分析细胞内化162

2.6 RNA抽提162

2.7 利用RT-PCR进行基因沉默162

2.8 通过MTS试验和流式细胞术分析细胞增殖及凋亡163

2.9 siRNA的电转化163

3 方法163

3.1 通过体外转录的BAFF-R R-1和HIV-1 gp120 A-1控制适配体的合成164

3.2 BAFF-R R-1适配体-黏性-STAT3 siRNA纳米颗粒的产生164

3.3 利用凝胶迁移试验测定分离常数164

3.4 利用激光共聚焦显微镜分析细胞内化166

3.5 通过定量RT-PCR分析STAT3 siRNA功能167

3.6 通过MTS试验分析细胞增殖168

3.7 利用流式细胞法分析细胞凋亡168

4 注释169

致谢170

参考文献170

第13章 一种用于在人黑色素瘤细胞中剪接转换寡核苷酸的功能运输的高通量筛选方法173

1 引言173

2 材料175

2.1 A375 pLuc细胞培养和SSO转染175

2.2 荧光素酶检测175

2.3 RT-PCR检测175

3 方法176

3.1 A375 pLuc细胞培养和SSO转染步骤（见注释9）176

3.2 荧光素酶检测176

3.3 RNA提取和RT-PCR（见注释10）177

4 注释179

参考文献180

第14章 RNA-蛋白纳米结构的设计、组装和评估182

1 引言182

2 材料184

2.1 设计184

2.2 合成185

2.3 电泳迁移率试验186

2.4 大气中原子力显微镜186

3 方法187

3.1 设计187

3.2 合成188

3.3 电泳迁移率试验（EMSA）190

3.4 大气中原子力显微镜（AFM）191

4 注释192

致谢194

参考文献194

第15章 利用CLIP-Seq技术在病毒中定位RNA和蛋白质的相互作用196

1 引言196

2 材料199

2.1 交联和免疫沉淀组分199

2.2 RNA片段化和提取试剂200

2.3 cDNA文库构建及序列组成200

3 方法200

3.1 紫外交联和RNA片段化200

3.2 免疫沉淀反应和RNA提取201

3.3 cDNA文库构建203

3.4 数据分析204

4 注释205

致谢205

参考文献206

第16章 用RCAP、RNA交联和肽段指纹识别技术定位蛋白质-RNA相互作用208

1 引言208

1.1 RCAP209

1.2 甲醛交联209

1.3 亲和捕获RNA210

1.4 质谱分析211

1.5 数据分析211

1.6 RCAP数据的独立确定212

2 材料213

2.1 RCAP试验：交联和胰蛋白酶消化试剂213

2.2 RCAP试验：RNA沉淀和重悬浮213

2.3 样品清除214

3 方法214

3.1 RCAP试验：RNA-多肽复共轭对配合物的制备214

3.2 RCAP试验：RNA-肽段复共轭对配合物的沉淀和再悬浮214

3.3 样品处理和质谱分析215

4 注释215

致谢216

参考文献216