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第一章 概述1

第一节 转基因动物的产生和发展1

一、转基因动物的产生1

二、动物转基因技术的发展2

三、转基因动物应用领域的拓展7

第二节 转基因猪技术现状及应用前景11

一、转基因猪技术现状11

二、转基因猪的应用现状与前景13

参考文献17

第二章 猪的配子与胚胎操作技术22

第一节 猪精液的采集、保存和输精技术22

一、猪精液的采集22

二、精液的质量检查和评定23

三、精液的保存26

四、输精技术31

第二节 母猪的同期发情和超数排卵技术34

一、母猪的同期发情技术34

二、母猪的超数排卵技术36

第三节 猪胚胎的采集和移植技术38

一、胚胎的采集38

二、胚胎的移植43

第四节 猪卵母细胞体外成熟及体外受精技术46

一、猪卵母细胞的采集47

二、猪卵母细胞的体外成熟48

三、猪精子的体外获能56

四、体外受精技术58

五、胞质内单精注射技术61

第五节 猪体细胞核移植（克隆）技术67

一、供体细胞的选择69

二、供体细胞的制备方法69

三、受体细胞的制备72

四、核移植操作技术73

五、融合及激活技术76

六、手工克隆技术78

七、重构胚的培养79

八、重构胚的移植81

九、猪体细胞核移植存在的问题及应用前景82

第六节 猪的iPS技术83

一、iPS细胞的制备技术83

二、猪iPS技术的应用前景91

三、iPS细胞目前存在的问题92

第七节 配子与胚胎操作的环境控制93

一、影响配子与胚胎操作的环境因素93

二、灭菌技术94

三、玻璃及塑料制品的清洗96

四、配子与胚胎操作室的设计及环境管理97

参考文献99

第三章 猪的基因工程技术112

第一节 转基因猪表达载体的构建112

一、目的基因及其全长序列的获取112

二、启动子的选择116

三、报告基因117

四、调控元件118

五、动物基因工程常用载体121

六、载体构建的一般流程132

第二节 基因打靶技术及其策略135

一、基因打靶载体的类型和构建方法135

二、胚胎干细胞基因打靶137

三、体细胞基因打靶139

四、基因打靶技术的发展及复杂调控139

五、基因打靶技术的应用和展望141

第三节 RNAi基因沉默载体的构建142

一、RNAi的研究142

二、RNAi的分子机制143

三、shRNA表达载体构建144

四、基因沉默技术在猪遗传改良上的应用146

第四节 其他猪基因组靶向修饰技术147

一、锌指核酸酶147

二、TALEN149

三、PhiC31整合酶149

参考文献151

第四章 猪的转基因技术155

第一节 显微注射法155

一、原核胚的获取156

二、基因的显微注射157

三、注射胚的移植160

四、原核注射法制备转基因猪的效率162

五、提高转基因效率的措施163

六、通过显微注射法实现基因的定位修饰和整合165

第二节 猪精子介导法166

一、精子介导转基因的机理166

二、精子介导制备转基因猪的方法168

第三节 体细胞核移植介导法170

一、供体细胞的选择及建系171

二、细胞的基因转染171

三、细胞筛选和阳性单克隆培养175

第四节 逆转录病毒感染法177

一、逆转录病毒载体的构建177

二、利用逆转录病毒载体制备转基因猪的路径181

第五节 其他制备转基因猪的方法183

一、精原干细胞途径183

二、人工染色体技术189

参考文献191

第五章 转基因猪的检测197

第一节 可视化识别检测197

一、荧光标记197

二、肤色标记198

第二节 整合检测198

一、样品的采集198

二、DNA的提取198

三、聚合酶链式反应（PCR）200

四、DNA斑点杂交202

五、Southern印记杂交204

六、外源基因整合位点的检测——染色体原位杂交技术208

七、转基因整合拷贝数的测定210

第三节 转基因猪外源基因的转录分析——mRNA检测212

一、组织或细胞中总RNA提取212

二、Northern印迹杂交215

三、RNase保护分析217

四、逆转录—聚合酶链式反应（RT-PCR）219

五、RNA斑点杂交220

第四节 转基因猪翻译水平——蛋白质产物检测220

一、蛋白质印迹技术221

二、免疫组织化学检测225

第五节 转基因猪表达产物的生物活性分析及功能测试230

一、表达产物的生物活性分析230

二、表达产物的功能测试233

参考文献235

第六章 转基因猪的安全调控技术237

第一节 转基因猪的安全性分析及解决方案237

一、转基因猪对食品的安全性分析及解决方案237

二、转基因猪对环境的安全性分析及解决方案241

三、转基因猪自身的安全性分析及解决方案242

第二节 标记基因的删除技术243

一、hit and run法243

二、双置换法244

三、位点特异性重组技术245

第三节 组织特异性表达252

第四节 外源基因的诱导表达254

一、四环素诱导表达系统254

二、蜕皮激素诱导表达系统257

三、他克莫司／雷帕霉素诱导系统257

四、RU486诱导系统258

参考文献259

第七章 转基因猪新品种培育262

第一节 外源基因在G0代中的整合状况及遗传稳定性262

一、随机整合262

二、定位整合267

第二节 G0代转基因猪的选择267

一、选择的内容和目标267

二、选择程序268

第三节 转基因猪纯合子的建立269

一、通过常规繁育技术建立转基因猪纯合子270

二、通过重复打靶技术建立转基因猪纯合子271

三、基因编辑技术273

第四节 转基因猪新品种的培育274

一、转基因猪新品种的培育目标274

二、转基因猪新品系的建立274

三、转基因猪新品种的建立275

四、转基因猪新品种的利用275

五、转基因猪种质资源的保存276

参考文献276

第八章 转基因猪的安全管理和安全评价279

第一节 我国农业转基因生物的安全管理体系279

一、我国农业转基因生物安全管理的法规建设279

二、我国农业转基因生物的管理和监控体系280

第二节 转基因猪的安全控制281

一、转基因实验猪场的安全控制282

二、转基因实验猪场的卫生防疫283

三、转基因实验猪场猪群处置规则285

第三节 转基因猪的安全评价286

一、转基因猪安全评价的内容286

二、各阶段的申报程序290

参考文献291