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第1章 基因修饰动物概述1

1.1 基因修饰动物的概念1

1.1.1 转基因动物2

1.1.2 基因敲除2

1.1.3 基因捕获5

1.1.4 其他理化因素引起的基因组修饰与基因修饰的区别5

1.2 转基因动物的命名6

1.2.1 转基因动物6

1.2.2 基因敲除／敲入动物8

1.2.3 条件性敲除小鼠的命名原则9

1.2.4 基因捕获突变动物的命名原则9

1.2.5 对携带遗传操作实体的品系和原种的命名规则9

1.3 基因修饰动物技术的价值10

1.3.1 使用小鼠做基因修饰研究的原因10

1.3.2 基因修饰动物模型与细胞模型的区别12

1.4 基因修饰的伦理学13

1.4.1 基因修饰对动物的危害13

1.4.2 环境和社会安全问题14

1.4.3 基因修饰动物涉及的伦理学问题15

1.5 基因修饰动物制备原理15

1.5.1 生殖生物学原理16

1.5.2 胚胎工程技术原理19

1.5.3 基因修饰技术原理与进展23

1.6 基因修饰技术发展趋势47

第2章 原核注射法制备转基因小鼠50

2.1 转基因载体的构建50

2.1.1 目的基因序列优化设计与克隆51

2.1.2 侧翼非翻译序列（UTR）和PolyA信号53

2.1.3 选择合适的启动子54

2.1.4 目的基因的连接58

2.1.5 质粒载体的选择58

2.1.6 注射前质粒的酶切与纯化59

2.2 动物的准备60

2.2.1 动物选择60

2.2.2 超数排卵与卵的收集62

2.3 原核注射64

2.3.1 显微注射工作站64

2.3.2 显微注射前的准备66

2.3.3 显微注射68

2.4 胚胎移植69

2.4.1 输卵管移植69

2.4.2 子宫角移植73

2.5 阳性转基因小鼠检测74

2.5.1 染色体水平的检测74

2.5.2 转录水平的检测76

2.5.3 翻译水平的检测77

2.5.4 转基因小鼠整体表型观察78

2.5.5 常规方法简介78

2.6 讨论82

2.6.1 转基因的总体效率82

2.6.2 转基因在小鼠体内的整合及表达效率分析83

第3章 基因敲除小鼠制备91

3.1 载体构建91

3.1.1 载体设计原则91

3.1.2 筛选阳性细胞克隆的策略93

3.1.3 载体的克隆94

3.2 胚胎干细胞96

3.2.1 ESC体外培养96

3.2.2 同源重组ESC的鉴别102

3.3 囊胚注射与胚胎移植105

3.3.1 囊胚注射105

3.3.2 胚胎移植107

3.3.3 利用性别和毛色鉴别基因敲除鼠108

3.4 注意事项109

3.4.1 基因插入109

3.4.2 基因敲除110

3.4.3 大片段敲除110

3.4.4 筛选基因的干扰111

3.4.5 异常表型111

3.4.6 遗传背景和修饰位点111

3.4.7 基因冗余和代偿机制112

3.4.8 补救方式112

3.4.9 重组效率112

3.4.1 0基因敲除策略的灵活运用112

第4章 条件性基因敲除114

4.1 位点专一性重组酶114

4.1.1 Cre/LoxP系统116

4.1.2 Flp/FRT系统123

4.1.3 其他重组酶124

4.2 小鼠条件性基因敲除125

4.2.1 条件性敲除载体的设计125

4.2.2 条件性同源重组敲除126

4.2.3 RNA干扰134

4.3 基因修饰小鼠可诱导表达系统134

4.3.1 基于四环素依赖的调控系统135

4.3.2 基于配体诱导重组酶系统的基因敲除142

4.3.3 注意事项146

第5章 基因捕获150

5.1 基因捕获的类型及特点150

5.1.1 基因捕获152

5.1.2 启动子捕获152

5.1.3 增强子捕获154

5.1.4 PolyA捕获154

5.1.5 可移除式外显子捕获156

5.1.6 定向捕获156

5.1.7 条件性基因捕获156

5.2 基因捕获示例159

5.2.1 捕获策略159

5.2.2 RT-PCR法确认基因捕获载体的插入位点160

5.2.3 利用X-Gal染色确认ESC中载体的插入位点162

5.3 完成基因型鉴定162

5.4 X-Gal染色鉴定胚胎、组织和切片中载体表达的特征164

5.5 讨论及注意事项165

5.5.1 载体的导入方法165

5.5.2 重复捕获165

5.5.3 基因捕获表达分析166

5.5.4 表型缺失166

5.5.5 突变基因的克隆和序列测定166

5.5.6 突变的适应性167

5.5.7 注意事项167

第6章 CRISPR/Cas和TALEN系统敲除169

6.1 CRISPR/Cas技术敲除169

6.1.1 载体设计169

6.1.2 敲除序列连接到pX260或pX330载体171

6.1.3 敲除序列连接到gRNA cloning载体（Church Lab）173

6.1.4 体外转录嵌合gRNA及Cas9 mRNA174

6.1.5 一步法（原核注射法）实现（多）基因敲除175

6.1.6 基因修饰检测176

6.1.7 注意事项177

6.2 TALEN技术敲除177

6.2.1 载体设计177

6.2.2 一步法构建载体操作步骤181

6.2.3 TALEN的体外转录188

6.2.4 制备基因敲除小鼠188

6.2.5 注意事项188

第7章 基因修饰小鼠繁育和保种189

7.1 建立基因修饰小鼠品系189

7.1.1 背景品系的选择189

7.1.2 建立新品系基因修饰小鼠190

7.2 基因修饰小鼠同类系育种策略193

7.3 新的基因修饰品系的育种194

7.3.1 成活率194

7.3.2 生殖力194

7.3.3 母性行为194

7.3.4 寿命194

7.3.5 基因型外显率195

7.3.6 性连锁195

7.4 基因修饰小鼠的表型分析195

7.4.1 对照组选择195

7.4.2 表型鉴定195

7.5 福利评价196

7.5.1 新生动物福利评价197

7.5.2 离乳后福利评价197

7.5.3 控制基因修饰小鼠繁殖数量的福利原则198

7.6 影响小鼠育种的因素200

7.6.1 垫料和产房材料201

7.6.2 环境改善201

7.6.3 食物供给201

7.6.4 日常饲养201

7.7 配子与胚胎保种202

7.7.1 配子和胚胎冷冻203

7.7.2 胚胎冷冻方法205

7.7.3 精子冷冻保存方法207

7.7.4 卵母细胞冷冻保存方法208

7.7.5 卵巢组织冷冻保存方法209

7.7.6 冷冻胚胎和配子的解冻210

7.7.7 冷冻保存卵巢组织的解冻方法212

7.8 体外受精方法213

7.8.1 IVF培养皿的准备213

7.8.2 精子样品的准备213

7.8.3 卵母细胞的收集214

7.8.4 受精卵的洗涤和培养214

7.8.5 讨论与注意事项215

参考文献217