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1基因工程概述1

目 录1

1.1基因工程概貌2

1.1.1基因工程的诞生和兴起2

1.1.2基因工程的特点与基本步骤4

1.1.3基因工程早期的开创性研究成就6

1.2基因工程技术的应用与发展趋势8

1.2.1全球性的基因工程争夺战8

1.2.2蛋白质工程的研究开发飞速发展11

1.2.3转基因动植物生产药物的研究迅速崛起12

1.2.4 医学科学研究取得巨大成就13

1.2.5基因治疗技术取得重大进展13

1.2.6规模空前的国际《人类基因组计划》提前完成14

1.3.1 基因工程制药发展态势15

1.3基因工程与生物制药15

1.3.2主要基因工程药物简介16

2基因工程常用的工具酶21

2.1限制性核酸内切酶21

2.1.1限制酶的发现21

2.1.2限制酶的种类22

2.1.3限制酶的命名23

2.1.4 Ⅱ型限制酶的特性23

2.1.5限制片段末端连接27

2.2 DNA连接酶27

2.2.1 DNA连接酶连接作用的特点27

2.2.2基因工程中常用的连接酶29

2.3 DNA聚合酶30

2.2.3 DNA连接酶连接作用的分子机理30

2.3.1 大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ31

2.3.2 Klenow大片段酶33

2.3.3 T4噬菌体DNAR聚合酶33

2.3.4经修饰的T7噬菌体DNA聚合酶34

2.3.5 TaqDNA聚合酶及Ampli TaqTMDNA聚合酶34

2.3.6反转录酶35

2.4 DNA修饰酶36

2.4.1末端脱氧核苷酸转移酶36

2.4.2碱性磷酸酶36

2.4.3 T4噬菌体多核苷酸激酶37

2.5.1 S1核酸酶38

2.5.2 Ba131核酸酶38

2.5单链核酸内切酶38

2.6核酸外切酶39

2.6.1核酸外切酶Ⅶ39

2.6.2核酸外切酶Ⅲ40

2.6.3λ核酸外切酶40

3基因工程常用的克隆载体41

3.1质粒载体41

3.1.1质粒概述41

3.1.2质粒DNA分子的特性43

3.1.3质粒载体的改造和构建47

3.1.4 pBR322质粒载体49

3.1.5 pUC质粒载体53

3.1.6其他重要的质粒载体55

3.2.1λ噬菌体的基本特性57

3.2λ噬菌体载体57

3.2.2λ噬菌体基因组的结构与功能59

3.2.3λ噬菌体载体的构建61

3.2.4常用的λ噬菌体载体64

3.2.5改良型λ噬菌体载体68

3.3粘粒载体70

3.3.1粘粒载体的构建70

3.3.2粘粒载体的特点70

3.3.3常用的粘粒载体71

3.4 M13噬菌体载体73

3.4.1 M13噬菌体的基本特性73

3.4.2 M13噬菌体载体的构建74

3.5.1 pUC118和pUC119噬菌粒载体77

3.5噬菌粒载体77

3.4.3 M13噬菌体载体系列的优点77

3.5.2 pBluescript噬菌粒载体78

3.6哺乳动物细胞载体系统80

3.6.1 SV40载体80

3.6.2牛乳头瘤病毒（BPV）载体80

3.6.3 EBV病毒载体81

4目的基因的制取82

4.1 目的基因的化学合成82

4.1.1 目的基因的设计82

4.1.2寡聚核苷酸片段的合成83

4.1.3寡核苷酸片段的分离和纯化84

4.1.4用寡核苷酸片段组装目的基因85

4.1.5化学合成寡核苷酸的其他用途86

4.2.2真核基因组DNA文库的构建过程87

4.2构建基因文库法分离目的基因87

4.2.1构建基因文库法分离目的基因的基本步骤87

4.3酶促合成法制取目的基因91

4.3.1 真核生物细胞中的mRNA91

4.3.2 从构建的cDNA文库中筛选目的cDNA91

4.3.3 RT-PCR法合成目的cDNA97

5目的基因与克隆载体的体外重组101

5.1 目的基因与质粒载体的连接101

5.1.1粘性末端连接法101

5.1.2定向克隆法104

5.1.3平末端连接法107

5.1.4同聚物加尾法107

5.1.5加人工接头连接法109

5.1.6加DNA衔接物连接法110

5.2目的基因与λ噬菌体载体的连接112

5.1.7其他转换末端形式连接法112

5.2.1 λ噬菌体载体臂DNA的制备113

5.2.2λ噬菌体载体臂与外源目的DNA片段的连接114

6重组克隆载体引入受体细胞115

6.1基因工程受体细胞115

6.1.1 受体细胞的特性115

6.1.2重组体分子导入受体细胞的途径116

6.2重组体DNA分子的转化或转染117

6.2.1 用氯化钙制备新鲜的感受态细胞转化法117

6.2.2用复合剂制备感受态细胞转化法118

6.2.3 高压电穿孔转化法（电转化法）118

6.3重组λ噬菌体DNA的体外包装与转导119

6.3.1λ噬菌体体外包装的基本原理119

6.3.3 包装提取物的制备120

6.3.2λ噬菌体DNA的体外包装120

6.3.4 重组λDNA的体外包装与感染方法121

6.4重组克隆载体导入哺乳动物细胞的转染122

6.4.1 磷酸钙和DNA共沉淀物转染法122

6.4.2 DEAE－葡聚糖介导转染法122

6.4.3 利用Polybrene（聚季铵盐）的DNA转染法122

6.4.4利用原生质体融合的DNA转染法123

6.4.5 电穿孔法DNA转染123

7含目的基因重组体的筛选、鉴定与分析124

7.1重组体（菌）的筛选124

7.1.1 抗生素抗性基因插入失活法124

7.1.2 β－半乳糖苷酶基因插入失活法124

7.1.3快速细胞破碎与凝胶电泳筛选法125

7.1.4放射性标记核酸探针杂交筛选法126

7.1.5免疫化学筛选法135

7.2重组体的鉴定136

7.2.1酶切及凝胶电泳鉴定法137

7.2.2 Southern印迹杂交法138

7.2.3电镜R－环检测法140

7.2.4基因产物鉴定法140

7.3重组DNA的序列分析141

7.3.1 Sanger双脱氧链终止法DNA测序141

7.3.2 Maxam-Gilbert化学修饰法DNA测序144

7.3.3快速自动化DNA测序146

8.1外源目的基因在原核细胞中的表达148

8.1.1原核基因表达载体的构成148

8目的基因在宿主细胞中的表达148

8.1.2常见的原核细胞表达载体系统152

8.1.3 外源目的基因在原核细胞的表达形式153

8.1.4在原核细胞中高效表达目的基因155

8.1.5基因定点诱变技术157

8.2外源目的基因在真核细胞中的表达161

8.2.1真核细胞表达载体的功能元件162

8.2.2酵母菌表达系统164

8.2.3哺乳动物细胞表达系统166

9基因工程药物无性繁殖系的组建170

9.1人胰岛素原融合蛋白重组菌的组建170

9.1.1 重组表达质粒pJG202的构建与鉴定170

9.2.1 hIFN-α2b基因的获得171

9.2.2重组表达质粒pMZI2B的构建171

9.1.3融合蛋白后处理成为人胰岛素原171

9.2人α2b型干扰素工程菌的组建171

9.1.2重组质粒pJG202在大肠杆菌中的表达171

9.2.3人α2b型干扰素工程菌的形成与基因的表达172

9.3集落刺激因子工程菌的组建173

9.3.1 细胞总RNA的提取173

9.3.2 PCR引物的设计与合成173

9.3.3 RT-PCR法制备GM-CSF cDNA173

9.3.4 GM-CSF重组表达载体与工程菌的组建173

9.4白细胞介素融合蛋白工程菌的组建174

9.4.1质粒与PCR引物174

9.4.2人IL-2 cDNA和PE基因的末端改造175

9.4.3 IL2-PE-pLY5重组质粒的构建175

9.5.3重组表达质粒在酵母细胞中的稳定性176

9.5.2重组表达质粒的转化及HBsAg的表达176

9.5.1 BsAg基因重组表达质粒pLS1和pLS2的构建176

9.5乙型肝炎表面抗原重组酵母的组建176

9.6人组织型纤溶酶原激活剂细胞株的组建177

9.6.1真核表达质粒pLFrGGI的构建178

9.6.2 高效表达FrGGI（tPA突变体）的CHO细胞株的获得178

9.6.3去除dhfr基因转录增强子的作用178

9.7红细胞生成素CHO细胞株的组建179

9.7.1质粒与细胞株179

9.7.2 EPO真核重组表达质粒pMGL4的构建179

9.7.3重组表达质粒转染COS-7细胞及产物表达179

9.7.4重组表达质粒转染CHO-dhfr－细胞及EPO表达179

9.8人肿瘤坏死因子昆虫细胞株的组建180

9.8.1 含hTNF-α基因的重组质粒的构建181

9.8.3重组病毒感染Sf21细胞及hTNF-α的表达182

9.8.2共转染与重组病毒的获得182

10基因工程药物的生产183

10.1基因工程菌（细胞）的培养与发酵183

10.1.1 工程细菌的培养与发酵183

10.1.2工程酵母的培养与发酵185

10.1.3工程细胞的培养与发酵185

10.2基因工程药物的分离纯化186

10.2.1 影响分离纯化工艺设计的主要因素187

10.2.2各种产物表达形式采用的分离纯化方法187

10.3基因工程药物的分离纯化实例189

10.3.1 以包涵体形式表达的rGM-CSF中试分离纯化189

10.3.2以分泌型表达的人α1－干扰素的分离纯化191

10.3.3以可溶性形式表达的rhG-CSF的分离纯化191

10.3.4在酵母中表达的HBsAg的分离纯化192

11.1.1 主要的基因工程药物194

11基因工程药物的检验194

11.1基因工程药物的质量控制194

11.1.2基因工程药物的特点195

11.1.3基因工程药物的质量要求195

11.1.4基因工程药物的质控要点196

11.1.5基因工程药物的制造及检定规程200

11.2基因工程药物常用的检验方法202

11.2.1化学检定法202

11.2.2肽图分析法202

11.2.3 外源性DNA残留量的测定203

11.2.4宿主细胞蛋白杂质的检测204

11.2.5无菌试验205

11.2.6内毒素试验208

11.2.7异常毒性试验209

11.2.8热原质试验210

11.2.9生物学活性（效价）检定211

11.3主要基因工程药物的检验211

11.3.1重组人胰岛素的检验211

11.3.2重组人生长激素的检验213

11.3.3重组人干扰素的检验215

11.3.4重组人白细胞介素的检验217

11.3.5重组人红细胞生成素的检验218

11.3.6重组人集落刺激因子的检验219

11.3.7重组人组织型纤溶酶原激活剂的检验221

11.3.8重组人肿瘤坏死因子的检验222

11.3.9重组乙型肝炎疫苗的检验222

附录224

参考文献230