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1.1　蛋白质纯化的意义1

1.2 纯化蛋白质常用的方法1

1　绪论1

1.3　蛋白质纯化的设计2

1.3.1　基本原则2

1.3.2　过程优化3

1.3.3 经济性4

1.4　规模化蛋白质纯化5

1.4.1　基本原则5

1.4.2　主要操作过程6

2　蛋白质样品的预处理11

2.1 蛋白质样品的提取和分离11

2.1.1 细胞的破碎12

2.1.2　蛋白质样品的分离15

2.2　蛋白质样品的浓缩17

2.2.2　超滤法18

2.2.1　吸附法18

2.2.3 沉淀法20

2.2.4　透析法21

2.2.5　冷冻干燥法21

2.2.6　双水相分离法21

2.3　蛋白质样品的沉淀22

2.3.1 盐析法23

2.3.2　有机溶剂沉淀法25

2.3.3　等电点沉淀法26

2.3.4　聚乙二醇沉淀法26

2.3.5　选择性沉淀法27

2.4　蛋白质样品的透析27

2.4.1　基本原理27

2.4.2 应用28

3.1　概述29

3.1.1　基本原理29

3　凝胶过滤色谱29

3.1.2　凝胶的性质和种类36

3.1.3　凝胶介质的选择41

3.2　凝胶柱的操作42

3.2.1　装柱42

3.2.2　样品和缓冲液的准备46

3.2.3 色谱条件47

3.2.4　加样和洗脱48

3.2.5　凝胶柱的再生及保存49

3.3　应用49

3.3.1　脱盐49

3.3.2　蛋白质分离50

3.3.3　测定蛋白质分子量51

3.3.4　蛋白质复性的研究51

3.3.5　其他52

4　离子交换色谱53

4.1　基本概念54

4.1.1 蛋白质的电性质55

4.1.2 离子交换理论60

4.1.3 离子交换的分辨率62

4.2 固定相：离子交换剂66

4.2.1　基本结构66

4.2.2　功能基团和酸碱性质67

4.2.3 离子交换剂的部分性质68

4.2.4 离子交换剂的类型74

4.3　流动相：缓冲液和盐86

4.3.1　缓冲液的类型87

4.3.2　缓冲液的pH和浓度88

4.3.3 离子对色谱行为的影响89

4.3.4　添加剂90

4.4　实验方案设计91

4.4.1 离子交换剂的选择91

4.4.2　缓冲液的选择和色谱条件的确定94

4.4.3 色谱柱的尺寸98

4.4.4　分批分离99

4.5 色谱技术100

4.5.1 离子交换剂的准备100

4.5.2　样品的准备102

4.5.3　加样103

4.5.4　洗脱技术105

4.5.5　样品的收集和处理113

4.5.6 离子交换剂的再生、清洗、消毒和储存114

4.6　应用实例115

4.6.1 用DEAE-Sepharose色谱分离真菌纤维素酶115

4.6.2 用Mono S和Mono Q连续色谱法从鸡肌肉组织分级分离糖酵解酶类116

4.6.3 用Mono Q阴离子交换分离白血病细胞N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的同工酶117

4.6.4 用Bio-Rex 70色谱分离眼镜蛇神经毒素的六种单乙酰基衍生物118

4.6.5 用阶段洗脱法大规模纯化人血清白蛋白和免疫球蛋白G119

5　亲和色谱120

5.1.1 配体和载体的选择121

5.1 亲和吸附剂121

5.1.2 亲和吸附剂的制备方法123

5.1.3 商品化基团特异性吸附剂128

5.2 色谱技术130

5.2.1　亲和色谱操作过程130

5.2.2 亲和色谱的操作注意事项132

5.2.3 亲和色谱的吸附容量与吸附效率132

5.3　亲和色谱的特殊类型133

5.3.1　凝集素亲和色谱133

5.3.2　免疫亲和色谱137

5.3.3　环氧乙烷丙烯酰胺珠亲和色谱140

5.3.4　金属螯合亲和色谱142

5.3.5　疏水作用色谱144

5.4.4　脂蛋白的纯化145

5.4.2　酶的纯化145

5.4.3　糖蛋白的纯化145

5.4　应用145

5.4.1　抗体和抗原的纯化145

6　共价色谱146

6.1　巯基的化学性质147

6.1.1 离子化、氧化、金属联结、烷基化147

6.1.2　巯基-二硫化物互换反应148

6.1.3　与活性二硫化物的反应149

6.1.4　巯基与二硫氧化物的反应150

6.2　含巯基的蛋白质151

6.2.1 生物体中的氧化还原态151

6.2.2　胞内与胞外的蛋白质151

6.2.3　蛋白质巯基基团的解蔽151

6.2.6　巯基基团的衍生化作用152

6.3　共价色谱的凝胶152

6.3.1 原理152

6.2.5　巯基的引入152

6.2.4　蛋白质二硫键的还原152

6.3.2　凝胶的基质153

6.3.3　凝胶的固定相153

6.3.4 固定相活性基团的比较153

6.3.5　凝胶固定相的引入155

6.3.6　凝胶的取代程度和实际容量157

6.4.2　蛋白样品的结合158

6.4.1　预备158

6.4 色谱技术158

6.4.3　洗涤159

6.4.4　还原洗脱159

6.4.5　巯基蛋白的回收160

6.4.6　巯基凝胶的再生161

6.4.7　反向共价色谱162

6.5 应用实例162

6.5.1　从刀豆中分离脲酶162

6.5.2　木瓜蛋白酶的纯化163

6.5.3　共价色谱的顺序洗脱164

6.5.4　巯基多肽的纯化165

6.5.5 大肠杆菌β-半乳糖苷酶的可逆固定165

6.5.6　蛋白质亚基的鉴定166

7 电泳技术167

7.1　概述167

7.1.1 原理167

7.1.2　分类169

7.1.3　介质170

7.1.4　电泳仪器172

7.1.5 染色方法173

7.2 常规聚丙烯酰胺凝胶电泳174

7.2.1 原理174

7.2.2 常规PAGE的类型175

7.2.3　影响分离结果的外在因素175

7.2.4　蛋白质分子量的测定176

7.2.5 常规PAGE的实验方法177

7.2.6 PAGE的应用范围181

7.3　SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳181

7.3.1 原理181

7.3.2 SDS-PAGE的类型182

7.3.3　影响分离结果的外在因素182

7.3.4　蛋白质分子量的测定183

7.3.5 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的实验方法183

7.3.6 SDS-PAGE的应用范围184

7.4　等电聚焦184

7.4.1 原理185

7.4.2 载体两性电解质pH梯度的形成186

7.4.3 载体两性电解质等电聚焦方法187

7.4.4 固相pH梯度的介质及其pH梯度的形成189

7.4.5 固相pH梯度等电聚焦方法192

7.5.2　双向电泳实验方法194

7.5.1 原理194

7.5 双向电泳194

7.4.6 等电聚焦的应用范围194

7.5.3 应用196

7.6　免疫电泳197

7.6.1 原理197

7.6.2 电泳方法199

7.6.3 应用200

7.7　蛋白质印迹200

7.7.1 原理200

7.7.2　试验材料的选择201

7.7.3　蛋白质印迹试验方法202

7.7.4 应用203

7.8　毛细管电泳203

8　特殊用途蛋白质的纯化204

8.1 测序用蛋白质的纯化204

8.1.1　测序蛋白纯化技术205

8.1.2 多肽的制备和纯化207

8.2 用于晶体学研究的蛋白质纯化208

8.2.1 蛋白质结晶方法211

8.2.2　不均一性对蛋白质结晶的影响214

8.3　融合蛋白的纯化218

8.3.1　融合蛋白的纯化过程219

8.3.2　蛋白质的水解保护225

8.3.3　常用融合技术227

8.3.4　融合蛋白纯化实例231

8.4 包含体的初步纯化233

8.4.1　影响包含体形成的因素233

8.4.2 细胞匀浆中包含体的分离233

8.4.3　包含体的洗涤233

8.5　膜蛋白的纯化234

8.5.1　蛋白质的溶解性235

8.5.2　膜蛋白的纯化237

8.6 治疗用蛋白质的纯化238

8.6.1 治疗用蛋白纯化的关键问题239

8.6.2　工艺确认242

9　不同来源蛋白质的纯化244

9.1　微生物细胞培养蛋白质的纯化244

9.1.1 色谱纯化方法244

9.1.2　蛋白质离子交换纯化245

9.2　哺乳动物细胞培养蛋白质的纯化250

9.2.1 工艺设计251

9.2.2　细胞分离252

9.2.3　产品的初步回收和分离252

9.2.4　主要纯化方法252

9.2.5　样品纯化举例——单克隆抗体的纯化253

9.2.6 消除污染254

9.3　动物组织蛋白质的纯化256

9.3.1　组织的选择256

9.3　亚细胞分级分离257

9.3.3 防止蛋白质的有害水解257

9.3.2　组织破碎257

9.3.5　膜蛋白的溶解259

9.3.6　动物蛋白质纯化举例260

9.4　植物组织蛋白质的纯化263

9.4.1 影响植物组织蛋白质纯化的因素263

9.4.2　材料来源263

9.4.3　确定植物蛋白种类的直接和间接策略267

9.4.4　样品纯化举例268

10　蛋白质的常用指标分析271

10.1　蛋白质的含量分析271

10.1.1 测定蛋白质浓度的方法271

10.1.2　紫外分光光度法271

10.1.3　Lowry法274

10.1.4　二喹啉甲酸检测法277

10.1.5 考马斯亮蓝染色法278

10.2　蛋白质的分子量测定281

10.2.1 SDS-PAGE凝胶电泳法测定蛋白质的分子量282

10.2.2　凝胶过滤色谱法测定天然蛋白质的分子量286

10.3　蛋白质的等电点测定288

10.3.1 蛋白质的等电点288

10.3.2　等电聚焦技术289

10.3.3　超薄聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦法测定蛋白质的等电点289

10.4　蛋白质的纯度分析294

10.4.1 纯度标准294

10.4.2 常用的纯度检测方法294

10.5　糖蛋白质中的糖含量分析296

10.5.1　糖蛋白的化学分析296

10.5.2　SDS凝胶中的糖蛋白染色法297

10.6　蛋白质和肽的N末端氨基酸测定299

10.6.1 FDNB法300

10.6.2　DNS分析法301

10.6.3　Edman降解法304

10.7　蛋白质N末端序列分析306

10.7.1　DNS-Edman法308

10.7.2 DABITC/PITC双偶合法309

10.8　蛋白质和肽的C末端分析313

10.8.1　概述313

10.8.2　C末端序列分析的羧肽酶Y法314

11　实验部分317

11.1 用于蛋白质纯化的仪器（工作站）317

11.1.1　蛋白质纯化系统的主要部件317

11.1.2 几种常见的蛋白质色谱系统320

11.2 蛋白质分离纯化实例322

11.2.1　蔗糖酶的分离纯化322

11.2.2　转谷氨酰胺酶的分离纯化323

11.2.3 纯化重组蛋白Pseudomonas aeruginosa外毒素A325

11.2.4 E.coli中RNA聚合酶的提取和纯化329

11.2.5　从E.coli中分离制备高纯度的去乙酰头孢菌素C合成酶330

参考文献334