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1 绪论——基因工程概况1

1.1 引言1

1.1.1 基因工程含义1

1.1.2 基因工程理论依据1

1.1.3 基因工程研究的基本技术路线3

1.1.4 基因工程研究发展史3

1.2 基因工程研究内容4

1.2.1 基础研究4

1.2.2 应用研究8

1.3 基因工程的安全性问题14

1.4 基因工程研究发展前景15

2 DNA重组16

2.1 DNA的组成和结构16

2.1.1 DNA的组成16

2.1.2 DNA的空间结构17

2.1.3 DNA复制起始位点和复制子的结构20

2.1.4 DNA转录启动子和转录区的结构22

2.2 天然DNA的制备25

2.2.1 天然DNA的来源和用度25

2.2.2 天然DNA的提取26

2.2.3 DNA的纯化30

2.2.4 DNA的浓缩33

2.3.1 限制性核酸内切酶34

2.3 限制性核酸内切酶和DNA片段化34

2.3.2 限制性核酸内切酶作用机制35

2.3.3 限制性核酸内切酶的识别序列36

2.3.4 限制性核酸内切酶切割DNA的位点39

2.3.5 限制性核酸内切酶反应系统41

2.3.6 限制性核酸内切酶的Star活性46

2.3.7 DNA分子片段化47

2.3.8 DNA分子的限制性图谱49

2.4 特异性DNA片段的PCR扩增54

2.4.1 PCR基本原理54

2.4.2 PCR扩增特异性DNA片段的主要条件56

2.4.3 PCR扩增DNA片段的方法59

2.4.4 常用的DNA片段PCR扩增系统60

2.5 DNA片段的化学合成60

2.5.1 寡核苷酸片段的化学合成的方法60

2.5.2 化学方法合成的DNA片段66

2.6 DNA片段大小的凝胶电泳检测68

2.6.1 琼脂糖凝胶电泳参数69

2.6.2 DNA片段(分子)大小的估算71

2.6.3 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳参数73

2.6.4 脉冲场凝胶电泳(CHFE)参数74

2.7 DNA片段的连接重组76

2.7.1 DNA连接酶76

2.7.2 DNA片段之间的连接77

2.7.3 DNA重组类型83

3 基因克隆载体85

3.1 质粒克隆载体86

3.1.1 与构建克隆载体相关的质粒性质86

3.1.2 构建质粒克隆载体的基本策略89

3.1.3 质粒克隆载体的构建90

3.2 病毒(噬菌体)克隆载体104

3.2.1 λ噬菌体克隆载体106

3.2.2 cosmid克隆载体112

3.2.3 M13噬菌体克隆载体115

3.2.4 CaMV克隆载体118

3.2.5 烟草花叶病毒(TMV)克隆载体123

3.2.6 SV40克隆载体124

3.2.7 反转录病毒克隆载体127

3.2.8 腺病毒克隆载体131

3.2.9 痘苗病毒克隆载体136

3.2.10 杆状病毒表达克隆载体138

3.3 染色体定位整合克隆载体138

3.3.1 定位整合克隆载体的几种模式139

3.3.2 定位整合克隆载体的定位整合效率141

3.3.3 定位整合克隆载体142

3.4 人工染色体克隆载体146

3.4.1 人工染色体克隆载体含义和特点146

3.4.2 人工染色体克隆载体的构建147

3.4.3 人工染色体克隆载体的应用148

3.5.1 启动子探针型克隆载体149

3.5 特殊用途克隆载体149

3.5.2 诱导型表达克隆载体150

3.5.3 反义表达克隆载体152

3.5.4 组织特异性表达克隆载体153

3.5.5 分泌型表达克隆载体156

3.5.6 双启动子表达克隆载体156

3.5.7 串联启动子表达克隆载体157

3.5.8 含增强子表达克隆载体158

4.1 目的基因159

4.1.1 结构基因组成159

4 目的基因的制备159

4.1.2 基因的排列162

4.2 目的基因的制备164

4.2.1 直接分离法164

4.2.2 构建基因组文库分离法166

4.2.3 cDNA基因文库的构建及目的基因分离178

4.2.4 利用聚合酶链式反应技术扩增目的基因195

4.2.5 基因的化学合成204

4.3 目的基因的分离207

4.3.1 目的基因的功能克隆207

4.3.2 序列克隆法210

4.3.3 筛选目的基因片段的差别杂交及减法杂交技片215

4.3.4 利用差示分析法分离目的基因克隆221

4.3.5 功能结合法筛选目的基因235

4.3.6 DNA插入诱变法分离目的基因237

4.3.7 应用基因定位克隆技术分离筛选目的基因240

4.3.8 基因的定位候选克隆法248

4.3.9 染色体显微切割与微克隆法249

4.3.10 根据生物大分子间的相互作用分离目的cDNA克隆251

5 目的基因导入受体细胞257

5.1 受体细胞257

5.1.1 原核生物细胞258

5.1.2 真菌细胞259

5.1.4 动物细胞260

5.1.3 植物细胞260

5.2 重组DNA分子转入原核生物细胞261

5.2.1 重组质粒DNA分子转化大肠杆菌261

5.2.2 重组λ噬菌体DNA分子转导大肠杆菌269

5.2.3 受体细胞的选择271

5.2.4 重组DNA分子转入真核细胞274

5.3 重组子的筛选285

5.3.1 遗传表型直接筛选法286

5.3.2 依赖于重组子结构特征分析的筛选法296

5.3.3 核酸分子杂交检测法297

5.3.4 免疫化学检测法313

5.3.5 转译筛选法317

5.3.6 亚克隆法318

5.3.7 插入失活法319

5.3.8 电子显微镜作图检测法321

5.3.9 转录产物作图322

5.3.10 基因表达产物分析法324

5.3.11 DNA序列测定法326

6 外源基因的表达342

6.1 基因表达的机制342

6.1.1 外源基因的起始转录342

6.1.2 mRNA的延伸与稳定性342

6.1.3 外源基因mRNA的有效翻译343

6.1.4 表达蛋白在细胞中的稳定性344

6.1.5 目的基因沉默345

6.2 基因表达的调控元件346

6.2.1 启动子346

6.2.2 增强子352

6.2.3 终止子353

6.2.4 衰减子354

6.2.5 绝缘子354

6.2.6 反义子355

6.3 外源基因表达系统355

6.3.1 大肠杆菌基因表达系统356

6.3.2 芽孢杆菌表达系统364

6.3.3 链霉菌表达系统367

6.3.4 蓝藻表达系统371

6.3.5 酵母表达系统374

6.3.6 哺乳动物细胞基因表达系统378

6.3.7 植物细胞基因表达系统385

6.4 基因表达产物的检测与分离纯化389

6.4.1 基因表达产物的检测389

6.4.2 基因表达产物的分离纯化394

7 基因工程应用399

7.1 基因工程药物399

7.1.1 基因工程激素类药物399

7.1.2 基因工程细胞因子类药物400

7.1.3 基因工程抗体403

7.1.4 基因工程受体404

7.1.5 基因工程疫苗405

7.2 转基因植物408

7.2.1 抗病虫害转基因植物408

7.2.2 抗逆转基因植物413

7.2.3 药用转基因植物414

7.2.4 转基因植物食品415

7.2.5 其他转基因植物417

7.3 转基因动物418

7.3.1 利用转基因动物改良动物品种418

7.3.2 转基因动物作为生物反应器419

7.3.3 转基因动物筛选药物420

7.3.4 转基因动物应用于人体器官移植422

7.4 基因治疗423

7.4.1 肿瘤的基因治疗424

7.4.2 分子遗传病的基因治疗430

7.4.3 心血管病的基因治疗433

7.4.4 艾滋病的基因治疗435

7.5 基因芯片437

7.5.1 基因芯片原理及技术437

7.5.2 基因芯片的应用440

8 基因工程的争论和安全措施443

8.1 对基因工程的争论444

8.2 生物安全的争论带来的全球关注和影响449

8.3 基因工程安全措施451

8.4 我国的生物技术发展及其安全问题455

附录461

2-1 限制性核酸内切酶酶族的识别序列和切割位点(一)461

2-2 识别序列甲基化对限制性核酸内切酶切割活性的影响463

2-3 无磷酸化的寡核苷酸连杆473

2-4 部分MCS连杆475

3-1 λDNA上的限制性核酸内切酶识别位点477

8-1 1993年12月24日中华人民共和国国家科学技术委员会第17号令发布的《基因工程安全管理办法》479

8-2 我国1997年颁布的《农业生物基因工程安全管理实施办法》485

8-3 我国2001年6月6日颁布的《农业转基因生物安全管理条例》506

参考文献517