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第一章 抗血清的制备1

第一节 抗原的制备1

一、概述1

二、免疫原的制备1

第二节 佐剂15

一、佐剂的概念和作用15

二、常用佐剂的化学组成和制备方法17

第三节 免疫血清制备18

一、概述18

二、免疫血清制备19

第二章 单克隆抗体的制备23

第一节 鼠源性单克隆抗体的制备23

一、基本原理23

二、单克隆抗体杂交瘤的制备24

三、大鼠源性单克隆抗体的制备31

四、主要器材及试剂配制31

第二节 单克隆抗体的大量制备33

一、动物体内诱生单克隆抗体的方法33

二、体外培养生产单克隆抗体的方法34

第三节 人单克隆抗体制备34

一、杂交瘤技术制备人单克隆抗体35

二、转化B淋巴细胞制备人单克隆抗体35

三、人单克隆抗体的生产36

四、鼠-人嵌合抗体36

第四节 双特异性抗体的制备36

一、基本原理36

二、双特异性抗体制备37

三、双特异性抗体的大量制备与纯化40

第五节 噬菌体抗体库技术41

一、基本原理41

二、噬菌体抗体库实验方法42

第三章 抗体的纯化及检定51

第一节 单克隆抗体的纯化与鉴定51

一、腹水的预处理52

二、盐析法52

三、硫酸铵盐析法纯化单克隆抗体55

四、低温无水乙醇沉淀法55

五、辛酸提取法56

六、辛酸-硫酸铵盐析法纯化单克隆抗体56

七、缓冲液转换56

八、亲和层析法57

九、免疫球蛋白亚类的分离61

十、离子交换层析62

十一、离子交换层析纯化单克隆抗体64

十二、凝胶过滤66

十三、疏水层析68

十四、其它方法69

第二节 纯化产物纯度的检定及保存70

一、计算蛋白含量70

二、单双体含量检定71

三、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测单克隆抗体纯度71

四、聚丙烯酰胺电聚焦(IEF-PAGE)73

五、单克隆抗体的保存74

第三节 抗血清的吸收纯化与鉴定74

第四章 免疫扩散和免疫电泳技术76

第一节 概述76

第二节 免疫扩散77

一、单向免疫扩散77

二、双向免疫扩散78

三、逆向免疫扩散79

第三节 免疫电泳80

一、微量免疫电泳80

二、对流免疫电泳81

三、火箭免疫电泳82

四、交叉免疫电泳82

五、亲和免疫电泳83

第四节 Western印迹法84

第五章 免疫浊度法88

第一节 免疫浊度法的基本原理88

一、浊度分析的基本理论88

二、免疫浊度法89

第二节 免疫浊度法的主要类型90

第三节 分析仪器与试剂91

一、分析仪器91

二、免疫比浊试剂92

第四节 免疫浊度法的应用94

一、透射比浊法测定95

二、散射比浊法测定97

第六章 免疫凝集试验方法99

第一节 直接凝集反应99

一、玻片凝集反应100

二、试管凝集反应100

第二节 间接凝集反应102

一、间接血凝反应102

二、胶乳凝集试验108

三、明胶凝集试验109

第三节 协同凝集反应110

第四节 抗球蛋白试验111

一、抗人球蛋白试验111

二、抗人球蛋白消耗试验113

第七章 与补体相关的实验方法119

第一节 概述119

第二节 补体活性的测定120

一、血清总补体溶血活性(CH50)测定120

二、旁路途径溶血活性(APH50)测定122

第三节 补体组分测定123

一、单向免疫扩散法测C3含量123

二、免疫溶血法测C4活性124

三、B因子测定125

第四节 补体结合试验127

第五节 免疫粘附血凝试验131

第六节 被动免疫溶血试验134

一、PIHT检测大肠杆菌不耐热肠毒素(LT)134

二、PIHT检测病毒、细菌及其他微生物抗体135

第七节 单向辐射红细胞溶解试验135

第八节 补体介导的细胞毒试验136

一、形态学方法136

二、MTT比色法137

三、靶细胞释放同位素法137

第九节 溶血空斑试验137

第八章 免疫复合物的检测方法140

第一节 概述140

一、免疫复合物的形成140

二、免疫复合物的生物学功能140

三、免疫复合物的抗原成分141

第二节 循环免疫复合物的检测141

一、抗原非特异性检测法141

二、抗原特异性检测法148

第三节 组织免疫复合物的检测149

一、免疫荧光法149

二、免疫酶染色法150

第九章 免疫细胞的分离、纯化和鉴定151

第一节 免疫细胞151

一、淋巴细胞151

二、辅佐细胞151

三、其它免疫细胞151

第二节 外周血免疫细胞的分离纯化和鉴定151

一、外周血白细胞的分离和纯化152

二、外周血单个核细胞的分离153

三、淋巴细胞的分离155

四、T淋巴细胞和B淋巴细胞的分离156

五、T细胞亚群的分离159

六、NK细胞分离162

七、单核细胞分离164

八、人外周血中性粒细胞制备165

九、树突状细胞(DC)166

十、红细胞的分离167

第三节 分离细胞的保存168

一、概述168

二、红细胞的保存168

三、淋巴细胞的保存169

第四节 组织免疫细胞的分离纯化和鉴定170

一、人体巨噬细胞的分离170

二、豚鼠腹腔巨噬细胞的分离170

三、组织单细胞悬液的制备171

四、骨髓抽吸物中单个核细胞的分离172

五、脾、淋巴结或扁桃体中单个核细胞的分离172

六、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的分离173

第十章 免疫细胞功能测定175

第一节 淋巴细胞功能测定175

一、淋巴细胞计数及其亚群检测175

二、T淋巴细胞功能的体内试验法178

三、淋巴细胞功能实验室检测法179

第二节 吞噬细胞功能测定185

一、白细胞功能测定185

二、巨噬细胞功能测定186

第三节 红细胞免疫功能检测187

第四节 有关移植免疫的细胞免疫功能测定188

第十一章 体外细胞增殖和细胞毒试验191

第一节 概述191

第二节 细胞增殖的检验方法192

一、3H-TdR掺入法192

二、MTT法193

三、XTT比色法194

四、酸性磷酸酶法195

五、结晶紫法196

六、BrdU标记法196

七、MTS/PMS比色法197

第三节 细胞毒试验方法198

一、常用的检测方法198

二、常见的细胞毒试验类型及方法200

三、其它205

第四节 单细胞DNA损伤的微凝胶彗星电泳检测法206

第十二章 常见细胞因子检测技术209

第一节 基本原理和方法209

一、生物学方法209

二、免疫学测定法212

三、分子生物学测定法214

第二节 各种细胞因子的生物学检测215

一、IFN-α微量板染色测定215

二、IFN-γ生物活性测定215

三、TGF-α的生物活性测定(琼脂平板法)216

四、TGF-β生物活性测定216

五、GM-CSF生物活性测定218

六、IL-1活性测定219

七、IL-2活性测定(MTT法)220

八、IL-3的生物活性测定222

九、IL-4的生物活性测定223

十、IL-5的生物学活性测定224

十一、IL-6生物活性测定224

十二、IL-7生物活性测定225

十三、IL-8生物活性测定225

十四、IL-10生物活性测定(D36肥大细胞增殖法)227

十五、IL-11的生物活性测定227

十六、IL-12的CT4S细胞增殖检测228

十七、IL-13生物活性测定229

十八、TNF-α活性测定(结晶紫掺入法)229

第三节 细胞因子受体检测230

第十三章 人白细胞抗原(HLA)的分型232

第一节 血清学分型方法232

一、HLA-ABC抗原的检测232

二、HLA-DP、DQ抗原的检测233

第二节 细胞学分型方法233

第三节 基因分型方法235

一、RFLP法235

二、PCR-RFLP法238

三、PCR-SSO(ASO)探针法241

四、PCR-SSP法242

五、PCR-指纹图法243

六、PCR-SSCP法243

第十四章 细胞凋亡的检测方法246

第一节 根据凋亡形态学特征的检测方法246

一、普通光学显微镜观察方法246

二、透射电子显微镜观察方法249

三、荧光显微镜观察方法251

第二节 根据凋亡的生化特征的检测方法252

一、琼脂糖凝胶电泳252

二、原位末端标记技术256

第三节 细胞凋亡的流式细胞仪检测技术259

一、固定细胞的染色方法259

二、非固定细胞的染色方法262

第四节 细胞凋亡模型的制备264

一、在体细胞凋亡模型的制备264

二、体外细胞凋亡模型的制备265

第十五章 细胞膜受体分析268

第一节 放射受体分析的原理及配体的标记268

第二节 受体的制备271

第三节 受体结合实验272

第四节 结果的计算275

第十六章 细胞内Ca2+、cAMP浓度的测定和细胞间通讯278

第一节 细胞内游离钙浓度的测定278

一、荧光分光光度计测定方法278

二、共聚焦激光显微系统检测细胞内游离钙280

第二节 组织和细胞cAMP的测定281

一、蛋白结合法281

二、放射免疫分析法283

三、样品中cAMP的提取283

第三节 细胞间通讯284

一、细胞通讯的基本概念和分类284

二、直接通讯的机制和检测285

第十七章 免疫微球的应用289

第一节 微球的分类289

一、磁性微球(又称磁珠)289

二、惰性微球289

三、活性微球290

四、乳化微球290

五、标记微球290

六、彩色微球290

七、其它290

第二节 微球的致敏方式290

一、物理吸附法291

二、化学交联法291

三、生物素-亲和素桥联接法291

四、多肽桥联接法292

五、直接组合法292

六、强迫吸附法292

第三节 免疫微球技术的应用292

一、凝集试验292

二、细胞分离和纯化293

三、生物大分子的纯化294

四、微生物的分离294

五、分子生物学领域的应用294

第四节 几种免疫微球应用实例294

一、乳胶微粒物理吸附抗原的免疫凝集反应294

二、免疫磁珠纯化人B淋巴细胞295

三、免疫磁珠分离NK和LAK细胞295

四、免疫磁珠检测HBsAg296

五、免疫磁珠检测能诱导T细胞功能性极化的CD3表面分子297

第十八章 流式细胞仪的原理及应用299

第一节 流式细胞仪原理299

一、概述299

二、流式细胞仪的基本工作原理299

第二节 样品的制备301

一、培养细胞的样品制备301

二、血液单细胞样品的制备301

三、新鲜实体组织单细胞悬液的制备303

四、石蜡包埋组织单细胞悬液的制备305

五、脱落细胞样品单细胞悬液的制备306

六、单细胞悬液的保存307

第三节 荧光探针及染色308

一、DNA、RNA探针308

二、检测细胞内钙浓度的荧光探针311

三、检测细胞膜电位探针312

四、测试细胞内pH值的荧光探针313

五、测量总蛋白含量的探针314

六、免疫荧光探针314

第四节 流式细胞仪资料显示基本形式317

一、单参数直方图317

二、双参数直方图317

第五节 流式细胞术的应用318

一、流式细胞术在免疫学中的应用318

二、流式细胞术在细胞生物学中的应用319

三、流式细胞术在肿瘤学中的应用320

四、流式细胞术在血液学中的应用321

第十九章 放射免疫分析技术322

第一节 放射免疫分析的基本原理322

第二节 放射免疫分析的建立及相关技术323

一、抗血清的制备323

二、放射性碘标记326

三、B和F的分离329

四、样品的制备331

五、标准曲线331

第三节 放射免疫分析的质量控制和方法学评价332

一、RIA质量评价的常用指标332

二、影响RIA质量的因素332

三、提高RIA结果准确度的方法333

四、RIA的质量控制334

第四节 试管固相放射免疫分析技术337

一、固相载体的选择及预处理337

二、塑料试管活化方法337

三、固相抗体的制备338

四、免疫分析方法的选择338

第五节 放射免疫分析的应用339

第二十章 酶联免疫检测方法342

第一节 基本原理342

一、固相酶免疫测定法的基本原理342

二、均相酶免疫测定法的基本原理348

三、双抗体酶免疫测定法的基本原理349

四、常用酶类及其底物349

五、葡萄球菌A蛋白350

六、酶标记物的制备351

第二节 酶联免疫吸附实验(间接法)352

第三节 竞争法356

第四节 双夹心法357

第五节 桥联法358

第六节 均相酶免疫测定359

第七节 其它类型和方法360

一、免疫酶斑点技术(dot-ELISA)360

二、PCR-ELISA361

三、ABC-ELISA363

第二十一章 荧光和化学发光免疫技术365

第一节 荧光免疫技术365

一、原理365

二、荧光抗体的制备365

三、荧光抗体染色方法368

四、荧光抗体技术的应用370

五、荧光偏振免疫分析370

六、时间分辨荧光免疫分析372

第二节 发光免疫分析374

一、发光免疫分析的原理及种类374

二、化学发光免疫分析374

三、电化学发光免疫分析378

四、微粒子化学发光379

五、生物发光免疫分析379

第二十二章 免疫组织化学实验方法382

第一节 免疫组织化学实验方法概况382

一、抗体的制备和配制382

二、组织材料的处理383

三、免疫染色388

四、对照389

五、免疫细胞化学的结果判断390

六、微波与免疫组织化学抗原修复390

七、压力与免疫组化抗原修复391

第二节 免疫荧光细胞组织化学技术392

一、直接法392

二、间接法392

三、补体法393

四、双重免疫荧光标记法393

五、荧光染色注意事项393

六、荧光显微镜标本制作要求394

七、使用荧光显微镜注意事项394

八、荧光图象的记录方法394

第三节 免疫酶细胞组织化学技术394

一、酶标抗体法394

二、非标记抗体酶法395

第四节 亲合组织化学技术398

一、生物素-抗生物素免疫细胞组织化学染色技术398

二、葡萄球菌蛋白A(SPA)401

三、凝集素402

第五节 光镜免疫金银细胞组织化学技术404

一、光镜免疫金技术404

二、免疫金银法405

三、彩色免疫金银法(CIGSS)407

第六节 免疫胶体铁细胞组织化学技术407

一、胶体铁的制备方法407

二、抗体的标记和纯化408

三、胶体铁标记抗体的鉴定408

四、免疫胶体铁细胞组织化学染色步骤408

第七节 Envison免疫组织化学技术与微波Envision免疫组织化学技术408

第八节 非特异性染色的处理和染色结果评价409

一、非特异性染色的处理409

二、染色结果的评价410

第九节 抗体的管理和制成标本的摄影技巧411

一、抗体的管理411

二、制成标本的摄影技巧411

第二十三章 电子显微镜免疫细胞化学技术413

第一节 概述413

第二节 包埋前免疫电镜技术415

一、组织的固定415

二、免疫试剂在组织中的穿透417

三、非特异染色的形成及处理417

四、过氧化物酶的显色417

第三节 包埋后免疫电镜技术418

一、组织的固定418

二、组织的脱水、包埋418

三、超薄切片418

四、免疫染色419

第四节 免疫铁蛋白技术419

一、直接法420

二、间接法420

第五节 免疫酶细胞化学技术420

一、PAP包埋前染色法(实验动物大鼠)420

二、PAP包埋后染色422

第六节 免疫电镜胶体金技术422

一、包埋后染色423

二、电镜免疫金包埋前染色424

三、蛋白A-金免疫染色方法424

四、免疫金标记定量研究424

五、免疫胶体金标记冷冻劈裂技术425

第七节 胶体金和铁蛋白的标记425

一、铁蛋白标记抗体技术425

二、胶体金标记抗体技术426

第二十四章 原位杂交免疫细胞组织化学和免疫PCR技术431

第一节 原位杂交组织化学技术的基本方法431

一、玻片的预处理431

二、组织取材与固定剂的选择432

三、组织切片的处理433

四、杂交反应434

五、杂交后处理435

六、杂交体的检测435

七、对照实验和ISH结果判断435

第二节 组织细胞原位杂交程序438

一、细胞和组织片制作438

二、预杂交和杂交439

三、杂交后处理439

四、显色439

第三节 染色体原位杂交技术441

一、染色体的制备441

二、原位杂交442

三、信号检测442

四、显带复制442

第四节 原位杂交结合免疫组织细胞化学技术443

一、同位素原位杂交与免疫组化PAP法联合程序(先作ISH)443

二、非同位素原位杂交与免疫组化法(地高辛标记联合PAP法)443

第五节 双重标记原位杂交技术444

一、两种同位素标记探针的双重标记原位杂交444

二、结合放射性同位素和非放射性标记探针的双重标记原位杂交445

三、非放射标记探针的双重标记原位杂交446

第六节 电镜原位杂交技术447

一、应用同位素标记cRNA探针电镜原位杂交技术于染色体制片447

二、应用生物素标记DNA探针-PA-gold电镜杂交技术448

三、地高辛标记cRNA探针的电镜原位杂交技术448

第七节 原位PCR技术449

一、间接PCRIS450

二、RT-PCRIS451

第八节 原位引物延伸标记法452

附录Ⅰ 常用试剂的配制454

附录Ⅱ 常用计量单位及换算465