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1绪论1

1.1 MCs的物化特性及其毒性2

1.1.1 MCs的物化特性2

1.1.2 MCs的毒性4

1.2 MCs的提取提纯及分析测定5

1.2.1 MCs的提取提纯研究进展5

1.2.2 MCs的分析测定研究进展6

1.3 MCs污染的控制7

1.3.1 物理法8

1.3.2 氧化降解法9

1.3.3 生物降解法12

2研究内容及技术路线18

2.1 研究目标18

2.2 研究内容18

2.2.1 菌种筛选及其生理生化特征研究18

2.2.2 菌株的分子生物学鉴定18

2.2.3 菌株降解MC-RR特性18

2.2.4 基因USTB-05-A的克隆19

2.2.5 基因USTB-05-A的表达19

2.2.6 菌株降解MC-RR的第一步分子途径及机理19

2.3 技术路线20

3降解MC-RR菌株的筛选与生理生化特征21

3.1 实验材料与仪器设备21

3.1.1 蓝藻藻样21

3.1.2 菌种来源21

3.1.3 微生物培养基及培养条件21

3.1.4 药品与试剂21

3.1.5 主要仪器22

3.2 实验方法22

3.2.1 MC-RR的分析测定22

3.2.2 MC-RR提取提纯23

3.2.3 菌种筛选23

3.2.4 菌株细胞形态观察24

3.2.5 菌株生长曲线的绘制25

3.2.6 菌株耐盐性研究25

3.2.7 菌株耐酸碱性研究25

3.2.8 菌株抗生素抗性研究25

3.3 MC-RR的提取提纯结果25

3.4 菌种筛选结果26

3.4.1 混合菌种筛选26

3.4.2 纯菌种筛选27

3.5 菌落形态观察及革兰氏染色28

3.6 USTB-05的生长曲线28

3.7 菌株USTB-05的耐盐性29

3.8 菌株USTB-05的耐酸碱性29

3.9 USTB-05对抗生素的抗性29

3.10 本章小结29

4菌株USTB-05的分子生物学鉴定31

4.1 实验材料31

4.1.1 菌株和质粒31

4.1.2 培养基31

4.1.3 PCR引物32

4.1.4 药品与试剂32

4.1.5 常用的生物信息分析的相关软件及网站32

4.1.6 主要仪器32

4.2 实验方法33

4.2.1 USTB-05基因组DNA的提取33

4.2.2 PCR反应体系及步骤34

4.2.3 琼脂糖凝胶电泳35

4.2.4 目的基因的回收35

4.2.5 目的基因与pGEM-T Easy载体连接36

4.2.6 连接产物转化DH5α感受态细胞36

4.2.7 质粒的提取36

4.2.8 阳性克隆鉴定与测序37

4.2.9 16S rDNA序列分析与菌属鉴定38

4.3 USTB-05基因组DNA的提取结果38

4.4 16S rDNA的PCR扩增结果39

4.5 16S rDNA片段序列分析结果39

4.5.1 去载体39

4.5.2 BLAST搜索40

4.6 系统发育树的绘制42

4.7 本章小结43

5 USTB-05对MC-RR的降解特性研究44

5.1 实验材料44

5.1.1 菌种与试剂44

5.1.2 主要仪器44

5.2 实验方法45

5.2.1 溶解氧对USTB-05降解MC-RR的效应45

5.2.2 温度对USTB-05降解MC-RR的影响45

5.2.3 pH值对USTB-05降解MC-RR的影响45

5.2.4 USTB-05菌株对MC-RR的降解46

5.2.5 USTB-05菌株无细胞提取液（CE）制备46

5.2.6 CE对MC-RR的降解46

5.3 溶解氧的效应47

5.4 温度的影响结果47

5.5 初始pH值的影响结果48

5.6 不同培养条件下USTB-05的生长情况49

5.7 USTB-05菌株对MC-RR的降解49

5.8 无细胞提取液对MC-RR的降解50

5.9 本章小结54

6基因USTB-05-A的克隆55

6.1 实验材料55

6.1.1 菌种55

6.1.2 药品及试剂55

6.1.3 主要溶液56

6.1.4 主要仪器56

6.2 实验方法56

6.2.1 PCR获取USTB-05降解基因簇片段56

6.2.2 DNA凝胶电泳57

6.2.3 目的片段回收57

6.2.4 目的片段与T载体连接58

6.2.5 连接产物转化DH5α感受态细胞58

6.2.6 质粒提取58

6.2.7 阳性克隆鉴定及测序58

6.2.8 反向PCR获取USTB-05未知序列58

6.2.9 高保真PCR获取USTB-05菌完整降解基因60

6.2.10 设计基因USTB-05-A克隆引物62

6.2.11 PCR扩增、连接T载体、转化及鉴定63

6.2.12 pGEX-4T-1载体获得64

6.2.13 目的基因与pGEX-4T-1载体制备64

6.2.14 重组质粒pGEX-USTB-05-A/BL21 （DE3）构建65

6.2.15 阳性克隆鉴定及测序65

6.3 降解MC-RR基因初步探索65

6.4 反向PCR扩增未知序列67

6.4.1 反向PCR扩增结果67

6.4.2 序列分析拼接67

6.5 高保真PCR获取USTB-05菌降解MC-RR完整基因69

6.5.1 高保真PCR69

6.5.2 序列拼接69

6.5.3 获取开放阅读框（ORF）69

6.6 PCR扩增USTB-05-A基因70

6.7 克隆重组质粒转化大肠杆菌的阳性鉴定70

6.8 T Easy/ USTB-05-A测序结果71

6.9 USTB-05-A基因与pGEX-4T-1载体双酶切73

6.10 表达重组质粒转化大肠杆菌的阳性鉴定74

6.11 本章小结74

7基因USTB-05-A的表达76

7.1 实验材料76

7.1.1 菌种及主要药剂76

7.1.2 主要溶液76

7.1.3 主要仪器76

7.2 实验方法78

7.2.1 SDS-PAGE检测蛋白质表达78

7.2.2 USTB-05-A基因工程菌总蛋白提取及浓度测定79

7.2.3 影响诱导表达单因素条件试验79

7.2.4 最佳条件下的重组蛋白诱导表达80

7.2.5 重组蛋白酶包涵体鉴定81

7.2.6 重组蛋白酶的分离纯化81

7.2.7 表达蛋白酶的活性验证82

7.2.8 基因工程菌与USTB-05菌体降解MC-RR活性对比82

7.3 影响表达量的单因素影响结果83

7.4 最佳条件下重组蛋白酶诱导表达84

7.5 包涵体验证结果85

7.6 表达蛋白降解MC-RR活性验证85

7.7 重组蛋白酶初步分离89

7.8 USTB-05菌体与基因工程菌降解MC-RR活性对比89

7.9 本章小结95

8 USTB-05催化降解MC-RR第一步机理96

8.1 实验材料96

8.1.1 主要溶液96

8.1.2 主要仪器96

8.2 实验方法98

8.2.1 重组蛋白酶对MC-RR的降解98

8.2.2 MC-RR第一个降解产物质谱分析98

8.3 重组蛋白酶对MC-RR的降解结果99

8.4 MC-RR第一个降解产物质谱分析102

8.5 USTB-05降解MC-RR第一步途径推测103

8.6 本章小结105

9结论与展望106

9.1 主要结论106

9.2 主要创新点107

9.3 展望107

参考文献108

附录 USTB-05-A基因与mlrA基因序列118