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组织培养的发展1

组织培养的应用5

组织培养的类型11

细胞冻存练习38

细胞附着47

细胞间连接48

生长在matrigel上的A549细胞49

细胞周期50

细胞周期的阻滞和进行51

干细胞的分化53

细胞相互作用和细胞信号转导56

细胞系的演化58

有限的和连续的细胞系染色体数目60

小型组织培养实验室64

中型组织培养实验室64

带有毗邻准备室的组织培养实验室65

大型组织培养实验室66

温室69

洗测水槽和吸管冲洗器72

液氮储存和冷冻罐储存74

洁净台77

通过抽吸回收培养基79

Integra真空泵79

倒置显微镜80

电动加样器81

移液器81

带刻度的分装瓶82

重复移液器82

自动分装器83

多头移液器83

平板加样器84

平板读数器84

移液装置84

闭路电视85

CO2培养箱87

CO2培养箱示意图87

超纯水制备89

顶盖式高压蒸汽灭菌锅90

高压蒸汽灭菌器91

瓶盖式分装器92

玻璃器皿清洗机93

显微操作仪和加热器96

污染的可能性100

建议的工作区布局101

布局糟糕的工作区101

水平洁净台布置101

开放式工作台的工作区布置103

持盖方法103

洁净台的气流106

废液烧杯107

移液管插入方法109

装在盒子中的培养皿113

向培养瓶充入气体113

装载过满的吸管筒118

将吸管安装到移液器上的方法119

钢瓶及固定120

用于器械消毒的双层三角乙醇瓶122

微生物学安全通风橱127

培养基体积与细胞产量和培养器皿有效面积的关系136

多孔培养板136

培养皿137

塑料培养瓶137

多面培养瓶137

小型搅拌培养瓶138

通气型培养皿138

通气型培养瓶138

带螺帽的小瓶和三角瓶139

非随机生长140

CellMax中空纤维培养系统141

饲养层细胞的形态学144

渗透压计Roebling渗透压计（Camlab）的前面板、样品管和样品接口。该型号适合的样品量为50μl156

玻璃器皿的清洗与灭菌196

自动化瓶刷197

消毒瓶子198

虹吸移液管清洗机200

吸管的清洗和消毒201

半自动吸管填塞器（Bellco）201

灭菌烤箱201

包装螺口盖进行灭菌203

压力和温度的关系203

水的纯化207

无菌过滤216

一次性除菌过滤器217

大容量过滤219

蠕动泵过滤器219

大批量串联式过滤装置220

可重复使用的过滤器221

预过滤226

每只小鼠胚胎的总湿重与细胞产量235

小鼠胚胎235

小鼠的解剖236

自鸡蛋中取出鸡胚239

原代培养的策略241

原代外植块培养243

温胰蛋白酶消化245

细胞滤器247

冷胰蛋白酶消化248

温胰蛋白酶消化和冷胰蛋白酶消化250

鸡胚的分离252

用胶原酶解离组织255

机械法解离256

不健康细胞270

生长曲线和维持273

单层细胞传代275

连续传代278

搅拌培养280

平行培养物和抗生素283

克隆细胞产量286

稀释法克隆培养288

微孔板克隆培养290

饲养层294

悬浮克隆培养297

美希索中的克隆培养299

克隆培养环300

单层贴壁细胞克隆的分离培养302

悬浮细胞克隆的分离培养304

选择性饲养层310

黑色素瘤、成纤维细胞和胶质细胞的悬浮生长310

混杂培养物中过度生长311

密度梯度法分离细胞314

密度梯度混合器315

离心产生的梯度315

离心淘洗转头（Beckman）317

淘洗转子的分离室317

磁力分选法319

磁性活化细胞分选法（MACS）319

荧光活化细胞分选法（FACS）321

流式细胞仪322

FACSⅡ型打印图323

隆凸329

培养细胞形态举例331

为细胞学观察而设计的培养装置340

细胞甩片离心机341

滤膜细胞学342

染色体制备345

染色体染色348

核型制备349

DNA指纹355

DNA测序仪359

DNA绘谱361

同工酶电泳363

Agilent免疫分析机370

分化的调节377

旁分泌的相互作用378

克隆变异388

染色体畸变389

转化灶390

hTERT永生化细胞与对照组衰老细胞的累计群体倍增次数（PD）的比较397

细胞增殖的密度限制402

鸡心脏测定法406

滤膜皿侵袭407

纤维蛋白溶酶原激活剂408

污染的类型416

PCR检测支原体422

冷冻曲线431

固定并包裹冻存管431

颈口插头冷冻器432

Nalge Nunc冷冻器432

程控冷冻柜432

液氮罐434

液氮罐的设计435

冷冻细胞438

细胞复苏440

连续培养更新442

细胞的运输容器444

血细胞计数板447

CASY电子细胞计数器449

CASY细胞计数器操作示意450

CASY电子细胞计数器模拟显示452

Beckman Coulter Vi-CELL电子细胞计数器453

生长曲线463

多孔板培养466

生长曲线的解释467

饱和密度469

稀释细胞与进行集落试验472

贴壁效率的线性分布474

自动集落计数仪474

标记指数475

载片或培养皿的扫描477

生长分数477

单层细胞克隆形成实验485

存活曲线487

存活曲线的解释488

饲养层对抵抗分数的作用488

微滴定试验491

抑制百分率曲线493

持续时间的试验494

IC50下降的时间进程494

微滴定和克隆性存活之间的相关性495

器官型试验501

人脐带血管551

培养的血管内皮细胞555

嗅球切除561

培养的黑素细胞565

汇合的饲养层580

胃癌细胞系585

胰腺癌细胞系588

人神经胶质细胞瘤细胞系590

细胞密度对C6细胞GFAP表达的作用592

组织型培养和器官型培养594

器官培养595

球体内的分裂细胞600

转动室系统603

Synthecon旋转细胞培养系统604

滤膜培养皿607

Transwells607

支架和基质613

用MRI检测三维构建物内的细胞614

软骨构建物的MRI615

大搅拌瓶616

搅拌培养617

生物恒定器620

空气上升发酵器621

BelloCell充气器培养621

中空纤维灌流培养622

Membrof erm622

Nunc细胞工厂623

填充式Nunc细胞工厂624

Corning CellCube626

放在支架上的旋转培养瓶626

旋转瓶培养627

旋转瓶示例628

旋转鼓装置629

固定床反应器632

液床反应器632

生物反应器的程序控制634

NMR分析635

显微放射自显影术640

显微放射自显影照片641

体细胞融合及融合后杂交细胞的筛选674

杂交瘤的制备677

转基因682

第1章 绪论1

1.1历史背景1

1.2组织培养的优点7

1.2.1环境控制7

1.2.2样品的特征和均一性8

1.2.3经济、规模和机械化8

1.2.4体内环境的体外模拟8

1.3局限性8

1.3.1专业技能8

1.3.2量的问题9

1.3.3去分化和选择9

1.3.4细胞的起源9

1.3.5不稳定性10

1.4体外的主要差异10

1.5组织培养的类型10

第2章 培训纲要13

2.1目的13

2.2基本练习13

练习1无菌技术Ⅰ：吸取和移液15

练习2细胞培养介绍16

练习3无菌技术Ⅱ：准备培养基18

练习4单层细胞的换液19

练习5玻璃器皿的清洗和灭菌20

练习6水的准备与灭菌21

练习7无Ca2+和Mg2+的Dulbecco磷酸盐缓冲液（D-PBSA）的制备与灭菌22

练习8pH标准色阶的制备23

练习9以干粉配制培养基储液并过滤灭菌24

练习10用10×浓缩液配制完全培养基25

练习11以干粉配制完全培养基27

练习12用血细胞计数板或电子计数器计数细胞27

练习13悬浮生长细胞的传代29

练习14单层生长连续细胞系的传代31

练习15单层细胞的Giemsa染色33

练习16生长曲线的制作和分析34

2.3高阶练习36

练习17培养细胞的冻存36

练习18支原体的检测39

练习19细胞系鉴定40

练习20原代培养42

练习21单层细胞的克隆培养43

2.4特殊练习45

第3章 培养细胞的生物学46

3.1培养细胞的环境46

3.2细胞黏附46

3.2.1细胞黏附分子46

3.2.2细胞间连接48

3.2.3细胞外基质48

3.2.4细胞骨架49

3.2.5细胞迁移50

3.3细胞增殖50

3.3.1细胞周期50

3.3.2细胞增殖的控制51

3.4细胞分化52

3.4.1细胞分化的维持52

3.4.2细胞去分化52

3.5细胞信号传递55

3.6能量代谢56

3.7培养的开始57

3.8细胞系的演化58

3.8.1细胞的衰老59

3.9连续细胞系的形成59

3.10培养细胞的起源60

第4章 实验室设计与布局62

4.1规划62

4.2建设与使用65

4.3无菌室或套室布局67

4.3.1无菌操作区67

4.3.2层流原理67

4.3.3检疫室和防范室68

4.3.4操作台68

4.4培养68

4.4.1培养箱68

4.4.2温室69

4.5准备室71

4.5.1培养基制备71

4.5.2洗涮72

4.5.3储存73

第5章 设备76

5.1组织培养实验室的要求76

5.2无菌区77

5.2.1洁净台77

5.2.2吸管桶或吸管缸78

5.2.3抽气泵78

5.2.4手推车79

5.2.5倒置显微镜80

5.2.6离心机80

5.2.7无菌取液器——移液和分装80

5.2.8细胞计数器85

5.2.9视频摄像机和显示器85

5.2.10解剖镜85

5.3培养85

5.3.1培养箱85

5.3.2湿式CO2培养箱86

5.3.3温度记录仪88

5.3.4滚动架88

5.3.5磁力搅拌器88

5.4准备和灭菌88

5.4.1清洗88

5.4.2水的纯化89

5.4.3灭菌和干燥烘箱90

5.4.4蒸汽灭菌器（高压灭菌锅）90

5.4.5天平91

5.4.6pH计91

5.4.7磁力加热搅拌器92

5.4.8自动分装器92

5.4.9电导仪93

5.4.10渗透压计93

5.4.11玻璃器皿清洗机93

5.5储存94

5.5.1冰箱和冷冻箱94

5.5.2冷藏器94

5.5.3可控速率冷冻箱95

5.6实验室95

5.6.1计算机和网络95

5.6.2普通显微镜95

5.6.3低温冷冻箱95

5.6.4共聚焦显微镜96

5.6.5PCR循环仪96

5.7专用设备96

5.7.1显微注射装置96

5.7.2集落计数器96

5.7.3离心淘洗机96

5.7.4流式细胞仪97

5.8消耗性物品97

5.8.1吸管97

5.8.2血细胞计数板97

5.8.3培养器皿98

5.8.4无菌容器98

5.8.5注射器和针头98

5.8.6除菌过滤器98

5.8.7纸巾和棉签98

5.8.8消毒剂98

第6章 无菌技术99

6.1无菌技术的目标99

6.1.1无菌的维持99

6.2创造无菌环境的各种因素100

6.2.1安静的工作区域100

6.2.2工作面100

6.2.3个人卫生102

6.2.4试剂和培养基102

6.2.5培养物102

6.3灭菌操作102

6.3.1擦拭102

6.3.2加盖102

6.3.3灼烧103

6.3.4试剂瓶和培养瓶的操作103

6.3.5移液104

6.3.6倒出液体105

6.4层流105

6.5标准方法106

方案6.1在洁净台内进行无菌操作107

方案6.2在敞开的工作台上进行操作109

6.5.1培养皿和多孔培养板111

方案6.3培养皿和培养板的操作111

6.6仪器和设备112

6.6.1培养箱112

6.6.2盒装培养物113

6.6.3充入CO2气体113

第7章 安全性、生物伦理及验证114

7.1实验室安全114

7.2危险性评估114

7.3标准操作程序116

7.4安全规则116

7.5常规安全117

7.5.1操作者118

7.5.2设备118

7.5.3玻璃器皿和锐利的物品118

7.5.4化学毒性119

7.5.5气体120

7.5.6液氮120

7.5.7灼烧121

7.6火122

7.7放射性122

7.7.1摄入122

7.7.2放射性废弃物的处理122

7.7.3标记的试剂123

7.7.4高能源123

7.8生物危害性123

7.8.1生物防范水平123

7.8.2微生物学安全通风橱126

7.8.3人的活检材料128

7.8.4遗传操作130

7.8.5生物有害废弃物处理130

7.8.6熏蒸130

7.9生物伦理130

7.9.1动物组织130

7.9.2人体组织材料131

7.10验证132

7.10.1证明132

7.10.2来源132

7.10.3污染132

第8章 培养器皿和附着物134

8.1附着物134

8.1.1细胞的附着和生长134

8.1.2附着材料134

8.2培养器皿的选择135

8.2.1细胞产量135

8.2.2悬浮培养138

8.2.3通风138

8.2.4样品制备与分析139

8.2.5不均匀生长140

8.2.6价格140

8.3特殊系统140

8.3.1透性支持物140

8.4表面处理141

8.4.1基质覆盖141

8.4.2饲养层142

方案8.1细胞外基质（ECM）的制备143

8.4.3三维基质143

8.4.4金属附着物144

8.4.5非黏附性附着面144

第9章 成分明确培养基及补充物146

9.1培养基的发展史146

9.2物理化学特征146

9.2.1pH146

方案9.1pH标准色阶的制备147

9.2.2CO2和碳酸盐147

9.2.3缓冲作用149

9.2.4氧气155

9.2.5渗透压155

9.2.6温度156

9.2.7黏滞度157

9.2.8表面张力和成泡性157

9.3平衡盐溶液157

9.4完全培养基158

9.4.1氨基酸158

9.4.2维生素159

9.4.3盐类159

9.4.4葡萄糖159

9.4.5有机补充物159

9.4.6激素和生长因子160

9.4.7抗生素160

9.5血清161

9.5.1蛋白质161

9.5.2生长因子161

9.5.3激素163

9.5.4营养物及代谢物164

9.5.5脂类164

9.5.6矿物质164

9.5.7抑制物164

9.6培养基和血清的选择164

9.6.1批次预约166

9.6.2血清的测试167

9.6.3热灭活167

9.7其他添加物168

9.7.1氨基酸水解物168

9.7.2胚胎浸出液168

9.7.3条件培养基168

第10章 无血清培养基169

10.1含血清培养基的缺点169

10.2无血清培养基的优点178

10.2.1具有选择性179

10.2.2调节细胞增殖与分化179

10.3无血清培养基的缺点179

10.4血清的替代179

10.4.1无血清传代培养180

10.4.2激素180

10.4.3生长因子181

10.4.4血清中的营养物质181

10.4.5蛋白质和多聚胺181

10.4.6基质181

10.5无血清培养基的选择186

10.5.1无血清培养基的商业供应186

10.5.2血清替代物186

10.5.3适应无血清培养基190

10.6无血清培养基的研发190

10.7无血清培养基的制备191

10.8无蛋白培养基191

10.9小结191

第11章 准备与灭菌192

11.1准备试剂与用品192

11.2设备与液体的灭菌192

11.3设备193

11.3.1玻璃器皿193

方案11.1玻璃器皿的准备和灭菌196

11.3.2玻璃移液管199

方案11.2玻璃移液管的准备和灭菌199

11.3.3螺口盖202

方案11.3螺口盖的准备和灭菌202

11.3.4清洁剂的选择204

11.3.5种类繁杂的设备204

11.3.6可重复使用的灭菌过滤器205

方案11.4过滤装置的灭菌205

11.4试剂与培养基206

11.4.1水206

方案11.5超纯水（UPW）的制备和灭菌207

11.4.2平衡盐溶液208

方案11.6D-PBSA的配制与灭菌209

11.4.3培养基的配制与灭菌210

方案11.7用1×储存液配制培养基210

方案11.8用10×浓缩液配制培养基212

11.4.4干粉培养基215

方案11.9以干粉配制培养基215

11.4.5特制培养基216

方案11.10特制培养基的配制217

11.5培养基的灭菌218

11.5.1可高压灭菌的培养基218

11.5.2除菌过滤218

方案11.11用注射器式过滤器灭菌过滤221

方案11.12用真空过滤瓶灭菌过滤222

方案11.13用小型串联式过滤器灭菌过滤223

方案11.14用大型串联式过滤器灭菌过滤224

11.5.3血清225

方案11.15血清的收集与灭菌226

方案11.16血清的透析229

11.5.4其他试剂的准备与灭菌229

11.6培养基的质控、检测和储存230

11.6.1质量控制230

11.6.2无菌检测230

11.6.3培养检测231

11.6.4保存232

第12章 原代培养233

12.1原代培养的类型233

12.2组织分离234

12.2.1小鼠胚胎234

方案12.1分离小鼠胚胎234

12.2.2鸡胚238

方案12.2分离鸡胚238

12.2.3人体活检材料240

方案12.3人体活检组织240

12.3原代培养241

12.3.1原代外植241

方案12.4原代外植242

12.3.2酶的解离作用244

12.3.3温胰蛋白酶消化244

方案12.5温胰蛋白酶解离组织244

12.3.4低温预处理的胰蛋白酶消化247

方案12.6冷胰蛋白酶解离组织248

12.3.5鸡胚器官原基250

方案12.7鸡胚器官原基251

12.3.6其他酶解过程254

12.3.7胶原酶254

方案12.8胶原酶解离组织255

12.3.8机械法解离257

方案12.9利用筛网的机械分离法258

12.3.9分离活细胞258

方案12.10富集活细胞259

12.3.10原代培养小结261

12.3.11原始记录261

第13章 传代培养和细胞系262

13.1传代培养和扩增262

13.2术语定义262

13.3培养物的年龄268

13.4细胞系的命名268

13.5选择细胞系268

13.6常规培养269

13.6.1细胞形态的意义270

13.6.2培养基的更换270

方案13.1单层培养细胞更换培养液271

13.7传代273

13.7.1传代标准274

方案13.2单层细胞的传代276

13.7.2生长周期和传代比率278

13.7.3传代时的细胞浓度279

13.7.4悬浮培养细胞的扩增279

13.7.5悬浮生长细胞的传代280

方案13.3悬浮细胞传代281

13.7.6培养条件的标准化282

13.7.7抗生素的使用282

13.7.8培养记录283

第14章 克隆培养及筛选286

14.1克隆培养286

方案14.1稀释法克隆培养287

14.2贴壁率的刺激291

14.2.1促进克隆生长的条件291

14.2.2条件培养基292

方案14.2条件培养基的制备292

14.2.3饲养层细胞293

方案14.3饲养层的准备293

14.3悬浮克隆培养295

方案14.4琼脂中克隆培养295

方案14.5美希索中克隆培养298

14.4细胞克隆的分离300

方案14.6用克隆环分离细胞克隆300

方案14.7辐射法分离细胞集落302

14.4.1单层贴壁细胞克隆的其他分离技术303

14.4.2悬浮细胞克隆303

方案14.8悬浮细胞克隆的分离304

14.5复制性培养305

14.6选择性抑制剂305

14.7遗传变异细胞的筛选306

方案14.9氨甲蝶呤抗性和DHFR扩增306

14.8细胞与基质的相互作用308

14.8.1选择性黏附308

14.8.2选择性脱壁308

14.8.3基质性质309

14.8.4选择性饲养层309

14.8.5半固体培养基选择309

第15章 细胞分离312

15.1细胞密度及等密度沉降法312

方案15.1密度梯度细胞分离法312

15.2细胞体积与沉降速度316

15.2.1单位重力沉降316

15.2.2离心淘洗分离技术316

15.3以抗体为基础的分离技术318

15.3.1免疫盘化法318

15.3.2免疫磁珠分选318

方案15.2磁性活化细胞分选法（MACS）320

15.4荧光活化的细胞分选法321

15.5其他分离技术324

15.6初试细胞分离者的选择325

第16章 细胞鉴定326

16.1鉴定的需求326

16.2保存记录和身世326

16.3真实性验证326

16.3.1种属鉴定328

16.3.2谱系或组织标记328

16.3.3独特标记330

16.3.4转化330

16.4细胞形态学330

16.4.1显微镜使用336

方案16.1倒置显微镜的使用337

16.4.2染色338

方案16.2Giemsa染色338

方案16.3结晶紫染色339

16.4.3细胞学检查所用培养器皿339

16.4.4悬浮细胞细胞学研究标本的制备340

方案16.4利用细胞甩片机制备用于细胞学研究的悬浮细胞341

方案16.5过滤细胞学342

16.4.5显微照相技术343

方案16.6显微镜数码照相343

16.5染色体含量344

方案16.7染色体制备344

16.5.1染色体显带技术347

16.5.2染色体分析348

16.5.3染色体彩绘350

16.6DNA含量350

16.6.1DNA杂交350

16.6.2DNA指纹技术350

方案16.8细胞系的多位点DNA指纹检测351

16.6.3DNA绘谱356

方案16.9细胞系的DNA STR谱356

16.7RNA和蛋白质表达362

16.8酶活性362

16.8.1同工酶363

16.8.2利用Authentikit进行同工酶电泳363

方案16.10同工酶分析364

16.9抗原标记367

16.9.1免疫染色369

方案16.11间接免疫荧光369

16.9.2免疫分析370

16.10分化371

第17章 分化372

17.1体内表现型的表达372

17.1.1去分化372

17.1.2细胞谱系的选择372

17.2分化的各个阶段373

17.3增殖和分化373

17.4定向和细胞谱系374

17.5干细胞的可塑性375

17.6分化标记物376

17.7诱导分化377

17.7.1细胞间相互作用377

17.7.2全身性或外源性因子379

17.7.3细胞-基质相互作用382

17.7.4极性和细胞形状383

17.7.5氧张力384

17.8分化和恶性384

17.9应用384

第18章 转化和永生化386

18.1细胞系特性的作用386

18.2什么是转化387

18.3遗传不稳定性388

18.3.1染色体畸变388

18.3.2DNA含量的变化389

18.4永生性389

18.4.1衰老的控制390

18.4.2利用病毒基因产生永生性391

18.4.3人类成纤维细胞的永生化392

方案18.1成纤维细胞的永生化393

18.4.4端粒酶诱导的永生化396

方案18.2用端粒酶诱导人类间充质干细胞永生化397

18.4.5转基因小鼠401

18.5生长控制的异常401

18.5.1停泊非依赖性401

18.5.2接触抑制402

方案18.3细胞增殖的密度限制403

18.5.3血清依赖性404

18.5.4肿瘤基因405

18.6肿瘤发生405

18.6.1恶性肿瘤405

18.6.2肿瘤移植406

18.6.3侵袭性406

18.6.4血管形成407

18.6.5纤溶酶原激活剂407

第19章 污染409

19.1污染源409

19.1.1操作人员的技术411

19.1.2环境411

19.1.3层流洁净台的使用和维护412

19.1.4潮湿培养箱412

方案19.1清洁培养箱413

19.1.5冷藏设备413

19.1.6无菌材料414

19.1.7引入的细胞系和活检材料414

19.1.8检疫414

19.2微生物污染的类型414

19.3污染的检测415

19.3.1可见的微生物污染415

19.3.2支原体417

19.3.3支原体荧光染色417

方案19.2荧光检测支原体418

19.3.4PCR检测支原体419

方案19.3PCR测定支原体420

19.3.5检测支原体的其他方法422

19.3.6病毒感染423

19.4污染的去除423

19.4.1细菌、真菌和酵母423

方案19.4消除微生物污染424

19.4.2支原体的消除424

19.4.3病毒污染的消除425

19.4.4持久的污染425

19.5交叉污染426

19.6结论426

第20章 细胞冷冻保存428

20.1冷冻保存的必要性428

20.2冷冻保存细胞系的获得428

20.3冷冻保存的原理429

20.3.1细胞冷冻的理论基础429

20.3.2细胞浓度429

20.3.3冷冻液430

20.3.4冷冻速率430

20.3.5细胞冷冻器433

20.3.6冻存记录436

20.3.7冻存细胞的复苏436

方案20.1冷冻细胞438

方案20.2复苏冷冻的细胞440

20.4冷冻储备的设计与控制442

20.4.1冻存细胞的管理442

20.4.2冻存细胞的连续更替442

20.5细胞库443

20.6细胞的运送443

20.6.1冻存管443

20.6.2活的培养物444

第21章 定量445

21.1细胞计数445

21.1.1血细胞计数板445

方案21.1用血细胞计数板进行细胞计数445

21.1.2电子细胞计数449

方案21.2借电阻进行电子细胞计数451

21.1.3单层培养的染色453

21.2细胞重量453

21.3DNA含量454

方案21.3用Hoechst33258测定DNA454

21.4蛋白质454

21.4.1样品的溶解性455

方案21.4用Bradford方法测定蛋白质含量455

21.5合成率456

21.5.1DNA合成456

方案21.5以3H-TdR掺入测定DNA合成456

21.5.2蛋白质合成457

方案21.6蛋白质合成458

21.6酶检测和免疫检测标本的制备459

21.7细胞计数术459

21.7.1原位标记459

21.7.2流式细胞术459

21.8重复取样问题459

21.8.1数据的获得460

21.8.2数据分析460

21.9细胞增殖461

21.9.1实验设计461

21.9.2生长周期461

方案21.7培养瓶中单层培养细胞生长曲线的绘制462

方案21.8多孔培养板中单层培养细胞生长曲线的绘制464

21.9.3单层培养细胞生长曲线的分析465

21.9.4培养液体积、细胞浓度和细胞密度466

21.9.5悬浮培养467

方案21.9悬浮培养细胞生长曲线的绘制467

21.9.6生长周期分析468

21.9.7生长曲线的变化470

21.1.贴壁效率470

方案21.10贴壁效率的测定471

21.10.1集落形成的分析473

21.10.2自动集落计数473

21.11标记指数474

方案21.113H-胸腺嘧啶脱氧核苷的标记指数475

21.11.1生长分数476

方案21.12生长分数的测定478

21.11.2有丝分裂指数478

21.11.3分裂指数478

21.12细胞周期时间478

21.13细胞迁移479

第22章 细胞毒性480

22.1活性、毒性和存活480

22.2体外局限性481

22.3分析的性质481

22.3.1生存力482

方案22.1染料排斥法测定细胞生存力482

方案22.2染料摄取法测定细胞生存力483

22.3.2存活484

方案22.3贴壁细胞的克隆形成实验484

22.3.3细胞增殖测定489

22.3.4代谢性细胞毒测定489

22.3.5微滴定试验489

方案22.4基于MTT的细胞毒性试验490

22.3.6微滴定与克隆存活的比较495

22.3.7药物的相互作用496

22.4细胞毒性试验的应用496

22.4.1抗癌药物筛选496

22.4.2肿瘤药物的前瞻性试验496

22.4.3药物学试验497

22.5转化和诱变497

22.5.1姐妹染色单体交换的诱变试验497

方案22.5姐妹染色单体交换498

22.5.2致癌性500

22.6炎症反应501

第23章 特殊类型细胞的培养503

23.1特殊细胞培养技术503

23.2上皮细胞504

23.2.1表皮504

方案23.1表皮角质形成细胞505

23.2.2角膜510

方案23.2角膜上皮细胞510

23.2.3乳腺512

方案23.3乳腺上皮513

23.2.4子宫颈514

方案23.4子宫颈上皮514

23.2.5胃肠道518

方案23.5结肠隐窝的分离和培养518

23.2.6肝520

方案23.6大鼠肝细胞的分离521

23.2.7胰523

方案23.7胰腺上皮523

23.2.8肾525

方案23.8肾上皮525

23.2.9气管和支气管上皮527

方案23.9气管和支气管上皮527

23.2.10口腔上皮529

方案23.10口腔角质形成细胞529

23.2.11前列腺531

方案23.11前列腺上皮531

23.3间充质细胞533

23.3.1结缔组织533

23.3.2脂肪组织534

方案23.12脂肪细胞的原代培养534

23.3.3肌536

方案23.13平滑肌细胞的分离和培养536

方案23.14从成年骨骼肌分离和培养成肌细胞538

方案23.15 从骨骼肌分离和培养单肌纤维540

23.3.4软骨542

方案23.16用藻酸盐微珠培养软骨细胞543

23.3.5骨546

方案23.17成骨细胞546

23.3.6内皮细胞548

方案23.18血管内皮细胞的分离和培养549

23.4神经外胚层细胞555

23.4.1神经细胞555

方案23.19小脑颗粒细胞的培养556

23.4.2神经胶质细胞557

方案23.20嗅球成鞘细胞559

23.4.3内分泌细胞562

23.4.4黑素细胞562

方案23.21黑素细胞的培养563

23.4.5黑素细胞的鉴定566

23.5造血细胞566

23.5.1骨髓细胞的长期培养567

方案23.22骨髓造血细胞的长期培养567

23.5.2造血细胞克隆形成实验568

方案23.23造血细胞集落形成实验569

23.6生殖腺571

23.7干细胞571

23.7.1胚胎干细胞572

23.7.2成体多能干细胞572

23.7.3干细胞来源和处理572

第24章 肿瘤细胞培养574

24.1肿瘤细胞培养中的问题574

24.2取材575

24.3分离576

24.4原代培养576

24.5肿瘤细胞的特征577

24.6细胞系的建立578

24.6.1连续细胞系578

24.7肿瘤细胞的选择培养578

24.7.1选择性培养基578

24.7.2汇合的饲养层579

方案24.1在汇合的饲养层上培养579

24.7.3悬浮克隆581

24.7.4组织型培养582

24.7.5异种移植582

24.7.6培养的肿瘤细胞特征583

24.7.7冷冻保存组织583

方案24.2冻存活检组织583

24.8特殊类型肿瘤584

24.8.1乳腺584

24.8.2肺584

24.8.3胃585

24.8.4结肠585

方案24.3结肠直肠肿瘤细胞的培养586

24.8.5胰腺588

24.8.6卵巢588

24.8.7前列腺589

24.8.8膀胱589

24.8.9皮肤589

24.8.10子宫颈590

24.8.11胶质细胞瘤590

24.8.12神经母细胞瘤591

24.8.13精原细胞瘤591

24.8.14淋巴瘤和白血病591

第25章 器官型培养592

25.1细胞的相互作用和表型表达592

25.1.1细胞密度的作用592

25.1.2相互作用593

25.1.3模型的选择593

25.2器官培养595

25.2.1气体和营养物质的交换595

25.2.2结构的完整性596

25.2.3生长与分化596

25.2.4器官培养的限制596

25.2.5器官培养的类型596

方案25.1器官培养597

25.3组织型培养598

25.3.1凝胶和海绵技术598

25.3.2中空纤维599

25.3.3球体599

方案25.2球体培养600

25.3.4转动室系统603

25.3.5藻酸盐活细胞固定术604

方案25.3藻酸盐包被605

25.3.6滤膜培养皿606

方案25.4滤膜培养皿607

25.3.7神经聚集物的培养609

方案25.5神经聚集物610

25.3.8组织等同物和组织工程612

25.4三维构建物中细胞的成像613

第26章 规模培养616

26.1悬浮规模培养616

方案26.14L分批式搅拌悬浮培养617

26.1.1连续培养619

26.1.2规模和复杂性620

26.1.3搅匀和换气620

26.2单层规模培养623

26.2.1多表面扩增器623

方案26.2Nunc细胞工厂624

26.2.2多列阵培养皿、螺旋柱和培养管625

26.2.3旋转培养626

方案26.3旋转瓶培养627

26.2.4微载体629

方案26.4微载体630

26.2.5巨载体631

26.2.6灌流式单层培养633

26.3程序控制633

第27章 特殊技术636

27.1淋巴细胞的分离636

方案27.1淋巴细胞的分离636

27.1.1未成熟细胞的转化637

方案27.2用PHA刺激淋巴细胞637

27.2放射自显影术638

方案27.3显微放射自显影术639

27.3间隔性记录645

方案27.4间隔性摄像645

27.4共聚焦显微镜648

27.5细胞同步化648

27.5.1细胞分离648

27.5.2阻断648

27.6羊膜细胞培养649

方案27.5羊膜细胞的培养649

27.7冷血动物细胞的培养657

27.7.1鱼细胞657

方案27.6斑马鱼胚胎细胞的培养658

27.7.2昆虫细胞662

方案27.7昆虫细胞的扩增662

27.8原位分子杂交663

27.8.1采用原位杂交技术对RNA基因表达的分析663

方案27.8原位杂交中的放射自显影技术664

27.8.2荧光原位杂交技术在分析基因及染色体中的应用670

方案27.9利用单拷贝基因组探针及染色体彩绘方法进行荧光原位杂交（FISH）670

27.9体细胞融合673

方案27.10细胞杂交675

27.9.1移核实验677

27.10单克隆抗体的制备677

方案27.11单克隆抗体的制备678

27.11DNA转移682

27.11.1磷酸钙共沉淀683

27.11.2脂质体介导的转染683

方案27.12脂质体介导的瞬时转染683

27.11.3电穿孔法685

方案27.13电穿孔法稳定转染686

27.11.4其他DNA转移方法688

27.11.5报告基因688

方案27.14β-半乳糖苷酶的原位染色688

方案27.15氯霉素乙酰基转移酶（CAT）测定689

第28章 问题与对策691

28.1细胞生长缓慢691

28.1.1个别人的培养体系出现问题691

28.1.2问题较为普遍，其他人也遇到同样的困难692

28.1.3实验室是否发生其他变化？692

28.2培养基693

28.2.1培养基的选择694

28.2.2某些不稳定试剂695

28.3配制培养基各种成分的纯度696

28.3.1纯水器工作是否正常？696

28.3.2碳酸氢钠696

28.3.3抗生素696

28.3.4血清697

28.4塑料制品697

28.5玻璃器皿697

28.5.1洗涤697

28.6微生物污染697

28.6.1针对某一位实验者而出现的问题698

28.6.2针对多位实验者共有的问题699

28.6.3污染物的鉴定701

28.6.4排除污染701

28.7化学污染701

28.7.1玻璃器皿701

28.7.2吸液管702

28.7.3水的纯度702

28.7.4其他试剂702

28.7.5粉末和气溶胶702

28.8原代培养703

28.8.1原代培养常见的问题703

28.8.2选择原代培养的细胞不恰当704

28.8.3污染704

28.9分化704

28.9.1细胞不发生分化704

28.9.2丧失产物形成能力704

28.10饲养层705

28.10.1常规单层培养705

28.10.2克隆培养705

28.11传代705

28.11.1传代培养的细胞周期705

28.11.2老化706

28.11.3培养基706

28.11.4生长不均匀706

28.12克隆706

28.12.1贴壁率低706

28.12.2集落弥散707

28.12.3每个培养皿中集落数目太多707

28.12.4非随机分布708

28.12.5细胞不贴壁708

28.13交叉污染708

28.13.1交叉污染的“体征”708

28.13.2交叉污染的“预防”709

28.13.3交叉污染的“治疗”709

28.14冻存709

28.14.1复苏时成活率低709

28.14.2冻存后细胞形态发生变化710

28.14.3污染710

28.14.4存货用罄710

28.15细胞呈颗粒性711

28.16细胞计数711

28.16.1使用血球计数板711

28.16.2使用有调节喷嘴的电子计数仪711

28.17存活率712

28.17.1形态学观察712

28.17.2存活率检测713

28.17.3细胞毒性检测713

第29章 结语714

附录Ⅰ试剂及配制715

附录Ⅱ设备及材料来源727

附录Ⅲ供应商和其他资源745

附录Ⅳ术语776

附录Ⅴ普通教科书及相关期刊782

参考文献784

索引830