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第1章 概述1

1.1 基因工程的基本概念1

1.1.1 基因工程的基本定义1

1.1.2 基因工程的基本过程1

1.1.3 基因工程的基本原理2

1.1.4 基因工程的基本体系2

1.2 基因工程的发展历史4

1.2.1 基因工程的诞生4

1.2.2 基因工程的成熟5

1.2.3 基因工程的腾飞5

1.3 基因工程的研究意义6

1.3.1 第四次工业大革命6

1.3.2 第二次农业大革命7

1.3.3 第四次医学大革命7

第2章 DNA重组克隆单元操作9

2.1 DNA重组的载体9

2.1.1 质粒载体9

2.1.2 病毒或噬菌体载体13

2.1.3 噬菌体-质粒杂合载体19

2.1.4 人造染色体载体21

2.2 DNA的体外重组（切与接）21

2.2.1 限制性核酸内切酶22

2.2.2 T4-DNA连接酶26

2.2.3 其他用于DNA重组的工具酶26

2.2.4 DNA切接反应的影响因素30

2.2.5 DNA分子重组的方法34

2.3 重组DNA分子的转化与扩增（转与增）41

2.3.1 重组 DNA转化的基本概念42

2.3.2 细菌受体细胞的选择43

2.3.3 细菌受体细胞的转化方法44

2.3.4 转化率及其影响因素47

2.3.5 转化细胞的扩增48

2.4 转化子的筛选与重组子的鉴定（检）48

2.4.1 基于载体遗传标记的筛选与鉴定49

2.4.2 基于克隆片段序列的筛选与鉴定51

2.4.3 基于外源基因表达产物的筛选与鉴定66

2.5 目的基因的克隆68

2.5.1 鸟枪法68

2.5.2 cDNA法71

2.5.3 PCR扩增法79

2.5.4 化学合成法85

2.5.5 基因文库的构建88

第3章 大肠杆菌基因工程93

3.1 外源基因在大肠杆菌中的高效表达原理93

3.1.1 大肠杆菌表达系统的启动子93

3.1.2 大肠杆菌表达系统的终止子98

3.1.3 大肠杆菌表达系统的核糖体结合位点99

3.1.4 大肠杆菌表达系统的密码子100

3.1.5 大肠杆菌表达系统的mRNA稳定性101

3.1.6 大肠杆菌表达系统的质粒拷贝数101

3.2 大肠杆菌基因工程菌的构建策略102

3.2.1 包涵体型重组异源蛋白的表达102

3.2.2 分泌型重组异源蛋白的表达105

3.2.3 融合型重组异源蛋白的表达108

3.2.4 寡聚型重组异源蛋白的表达112

3.2.5 整合型重组异源蛋白的表达116

3.3 重组异源蛋白的体内修饰与体外复性117

3.3.1 重组异源蛋白的稳定性维持117

3.3.2 重组异源蛋白的糖基化修饰119

3.3.3 包涵体型重组异源蛋白的体外溶解与变性121

3.3.4 包涵体型重组异源蛋白的体外复性与重折叠122

3.4 大肠杆菌工程菌培养的工程化控制126

3.4.1 细菌生长的动力学原理127

3.4.2 发酵过程的最优化控制129

3.4.3 大肠杆菌工程菌的高密度发酵131

3.4.4 基因工程菌的遗传不稳定性及其机制133

3.4.5 改善基因工程菌遗传不稳定性的对策134

3.5 利用重组大肠杆菌生产人胰岛素136

3.5.1 胰岛素的结构及其生物合成137

3.5.2 人胰岛素的生产方法138

3.5.3 产重组人胰岛素大肠杆菌工程菌的构建策略138

3.6 利用重组大肠杆菌生产人抗体及其片段141

3.6.1 重组抗体的生产策略141

3.6.2 由大肠杆菌生产重组抗体片段的优越性143

3.6.3 产重组抗体片段大肠杆菌工程菌的构建145

3.6.4 重组抗体及其片段表达产物的分离纯化149

第4章 原核细菌基因工程150

4.1 芽孢杆菌基因工程150

4.1.1 芽孢杆菌的载体克隆系统150

4.1.2 芽孢杆菌的宿主转化系统154

4.1.3 芽孢杆菌的基因表达系统155

4.1.4 芽孢杆菌的分泌折叠系统161

4.1.5 重组芽孢杆菌在耐热性酶制剂大规模生产中的应用165

4.1.6 重组芽孢杆菌在人体蛋白药物生产中的应用169

4.1.7 重组芽孢杆菌在昆虫毒素蛋白生产中的应用171

4.2 棒状杆菌基因工程174

4.2.1 棒状杆菌的载体克隆系统175

4.2.2 棒状杆菌的基因表达系统179

4.2.3 棒状杆菌的宿主转化系统183

4.2.4 赖氨酸基因工程菌的构建184

4.2.5 精氨酸基因工程菌的构建188

4.3 链霉菌基因工程192

4.3.1 链霉菌的载体克隆系统192

4.3.2 链霉菌的宿主转化系统198

4.3.3 链霉菌的基因表达系统200

4.3.4 链霉菌的蛋白分泌系统205

4.3.5 利用重组链霉菌分泌表达哺乳动物蛋白207

4.3.6 利用DNA重组技术改良抗生素生产菌208

4.4 梭菌属基因工程214

4.4.1 梭菌属的载体克隆系统215

4.4.2 梭菌属的宿主转化系统221

4.4.3 利用DNA重组技术改良有机溶剂的羧菌生产菌223

4.4.4 利用DNA重组技术改良羧菌属的纤维素分解酶系226

4.5 乳酸菌基因工程228

4.5.1 乳酸菌的载体克隆系统229

4.5.2 乳酸菌的诱导表达系统235

4.5.3 乳酸菌的宿主转化系统236

4.5.4 利用DNA重组技术改良食用乳酸菌238

4.5.5 利用DNA重组技术构建非食用乳酸菌工程株242

4.6 假单胞菌基因工程243

4.6.1 假单胞菌的载体克隆系统243

4.6.2 假单胞菌的宿主转化系统245

4.6.3 假单胞菌生物降解基因的克隆与鉴定246

4.6.4 假单胞菌生物降解途径的分子设计247

第5章 真菌基因工程253

5.1 丝状真菌基因工程253

5.1.1 丝状真菌的载体克隆系统253

5.1.2 丝状真菌的宿主转化系统258

5.1.3 丝状真菌的表达分泌系统262

5.1.4 丝状真菌重组异源蛋白的表达优化策略267

5.1.5 重组曲霉属在异源蛋白生产中的应用269

5.1.6 重组丝状真菌在次级代谢物生产中的应用271

5.2 酵母基因工程276

5.2.1 酵母的宿主系统276

5.2.2 酵母的载体系统279

5.2.3 酵母的转化系统286

5.2.4 酵母的表达系统291

5.2.5 酵母的蛋白修饰分泌系统307

5.2.6 利用重组酵母生产乙肝疫苗315

5.2.7 利用重组酵母生产人血清白蛋白316

第6章 昆虫基因工程320

6.1 果蝇的基因转化系统320

6.1.1 果蝇转座元件的结构及特征320

6.1.2 P元件介导的果蝇杂交不育321

6.1.3 P元件介导的果蝇经典转化程序322

6.1.4 果蝇体细胞的转化程序与表达系统324

6.2 蚊虫和农业害虫的基因改造系统325

6.2.1 用于非果蝇类昆虫转化的载体326

6.2.2 用于非果蝇类昆虫转化株筛选的标记基因331

6.2.3 农业害虫的基因工程332

6.2.4 蚊虫的基因工程339

6.3 家蚕的基因表达系统346

6.3.1 家蚕的分子生物学347

6.3.2 家蚕的杆状病毒基因表达系统348

6.3.3 家蚕生物反应器的构建354

6.3.4 抗病毒型转基因家蚕的构建359

第7章 高等动物基因工程362

7.1 高等动物细胞的基因转移系统362

7.1.1 用于基因转移的动物受体细胞362

7.1.2 动物细胞的物理转化程序364

7.1.3 动物细胞的化学转化程序365

7.1.4 动物细胞的病毒转染程序366

7.1.5 动物细胞的慢病毒载体系统372

7.2 利用动物转基因技术研究基因的表达与功能377

7.2.1 基于报告基因探测动物基因组中的调控序列及染色质转录活性状态377

7.2.2 基于同源重组敲除靶基因或敲入转基因379

7.2.3 基于位点特异性整合条件性敲除靶基因或敲入转基因379

7.2.4 基于位点特异性断裂条件性编辑基因组383

7.2.5 基于序列特异性互补条件性敲低靶基因386

7.3 利用动物转基因技术生产重组蛋白多肽389

7.3.1 高等动物转基因的表达特征389

7.3.2 高等动物转基因的表达元件391

7.3.3 利用高等动物工程细胞系生产医用蛋白394

7.3.4 利用高等动物细胞瞬时表达技术生产医用蛋白399

7.3.5 利用转基因动物的组织或器官生产医用蛋白401

7.4 利用转基因技术改良动物遗传性状404

7.4.1 转基因动物生成的原理与技术404

7.4.2 转基因动物生成的特征与应用410

7.4.3 转基因动物生成的挑战与前景416

7.5 基因治疗416

7.5.1 基因治疗的基本策略416

7.5.2 间接体内基因治疗418

7.5.3 直接体内基因治疗423

7.5.4 基因治疗面临的挑战与对策428

第8章 高等植物基因工程430

8.1 高等植物的基因转移系统430

8.1.1 Ti质粒介导的整合转化431

8.1.2 植物病毒介导的转染440

8.1.3 植物的物理转化方法443

8.1.4 植物细胞的化学转化法445

8.1.5 植物原生质体的再生445

8.2 高等植物的基因表达系统447

8.2.1 植物转基因的启动子／增强子447

8.2.2 植物转基因的非翻译区453

8.2.3 植物转基因的编码序列455

8.2.4 植物转基因的装配455

8.3 利用植物转基因技术研究基因的表达与调控457

8.3.1 利用T-DNA或转座子元件原位克隆鉴定植物功能基因457

8.3.2 利用病毒诱导型基因沉默机制鉴定植物功能基因459

8.3.3 利用增强子或启动子元件原位激活鉴定植物功能基因461

8.3.4 利用cDNA或ORF表达序列鉴定植物功能基因462

8.3.5 利用报告基因展示高等植物基因表达与调控的信息谱465

8.3.6 利用CRISPR／Cas系统编辑植物基因组466

8.4 利用转基因技术改良植物品种466

8.4.1 抗生物胁迫型转基因农作物的生成468

8.4.2 耐非生物胁迫型转基因农作物的生成471

8.4.3 提升光合效能型转基因农作物的生成474

8.4.4 改善品质型转基因农作物的生成478

8.4.5 转基因农作物的安全性482

8.5 利用转基因植物或细胞生产重组异源蛋白和工业原料482

8.5.1 植物生物反应器的构建策略483

8.5.2 利用植物生物反应器生产医用蛋白485

8.5.3 利用植物生物反应器生产食品或饲料添加剂486

8.5.4 利用植物生物反应器生产工业原料487

第9章 第二代基因工程——蛋白质工程488

9.1 蛋白质工程的基本概念488

9.1.1 蛋白质工程的基本特征488

9.1.2 蛋白质工程的研究内容及应用489

9.1.3 蛋白质工程实施的必要条件490

9.2 基因的体外定向突变490

9.2.1 局部随机掺入法490

9.2.2 碱基定点转换法491

9.2.3 部分片段合成法491

9.2.4 引物定点引入法494

9.2.5 PCR扩增突变法496

9.3 基因的体外定向进化497

9.3.1 易错PCR497

9.3.2 DNA改组498

9.3.3 体外随机引发重组498

9.3.4 交错延伸501

9.3.5 过渡模板随机嵌合生长501

9.3.6 渐增切割杂合酶生成501

9.3.7 同源序列非依赖性蛋白质重组502

9.3.8 突变文库高通量筛选模型的建立503

9.4 蛋白质工程的设计思想与应用505

9.4.1 提高蛋白质或酶类分子的稳定性505

9.4.2 减少重组多肽链的错误折叠508

9.4.3 改善酶的催化活性508

9.4.4 消除酶的被抑制特性511

9.4.5 修饰酶的催化特异性511

9.4.6 改造配体与其受体的亲和性512

9.4.7 降低异源蛋白药物的免疫原性515

第10章 第三代基因工程——途径工程518

10.1 途径工程的基本概念518

10.1.1 途径工程的基本定义518

10.1.2 途径工程的基本过程519

10.1.3 途径工程的基本原理521

10.2 途径工程的研究策略523

10.2.1 在现存途径中提高目标产物的代谢流523

10.2.2 在现存途径中改变物质流的性质523

10.2.3 利用已有途径构建新的代谢旁路526

10.3 初级代谢的途径工程527

10.3.1 乙醇生产菌的途径操作528

10.3.2 辅酶Q生产菌的途径操作534

10.3.3 氢气生产菌的途径操作541

10.4 次级代谢的途径工程542

10.4.1 聚酮生物合成的分子机制542

10.4.2 聚酮合酶各组成模块的操作策略542

10.4.3 聚酮生物合成基因的异源表达545

10.5 信号转导的途径工程547

10.5.1 信号转导途径的构成与功能547

10.5.2 信号转导途径的性能修饰549

10.5.3 信号转导途径的动力学行为修饰552

参考文献558