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第1章 大肠杆菌、质粒和噬菌体1

1.1.1 极限培养基2

1.1 培养基及常用工具的准备2

1.1.2 丰富培养基3

1.1.4 顶层琼脂培养基4

1.1.3 固体培养基4

1.1.6 实验工具5

1.1.5 穿刺琼脂培养基5

1.2.3 基本方案3 细菌培养的监测6

1.2.2 基本方案2 大体积培养6

1.2 在液体培养基中培养6

1.2.1 基本方案1 过夜培养6

1.3.3 基本方案3 通过铺平板分离单个菌落7

1.3.2 基本方案2 通过平板划线法分离单菌落7

1.3 在固体培养基中培养7

1.3.1 基本方案1 通过连续稀释法滴定和分离细菌菌落7

1.3.5 辅助方案2 菌株的保存和复苏8

1.3.4 辅助方案1 影印平板8

1.4 经典细菌遗传学选论9

1.5 质粒图谱13

1.6.2 备择方案 96孔微量滴定板碱裂解法20

1.6.1 基本方案1 碱裂解小量制备20

1.6 质粒DNA的小量制备20

1.6.3 基本方案2 煮沸小量制备法21

基本方案1 碱裂解法22

1.7.1 粗制裂解物的制备22

1.6.4 辅助方案 质粒DNA的保存22

1.7 质粒DNA的大量制备22

基本方案2 氯化铯／溴化乙锭平衡离心法23

1.7.2 备择方案 利用离子交换层析和分子筛层析纯化质粒DNA24

1.8.1基本方案1 CaCl2转化法25

1.8 将质粒DNA导入细菌细胞25

1.8.2 备择方案 一步法制备和转化感受态细菌26

1.8.3 基本方案2 高效率的电转化方法27

1.9 λ噬菌体概述28

1.9.1 裂解性生长29

1.9.2 溶原性生长30

1.10.2 选择插入的DNA31

1.10.1 用λ噬菌体的优点31

1.10 作为克隆载体的λ噬菌体31

1.11.1 基本方案1 通过连续稀释法分离单个噬斑34

1.11 λ噬菌体铺平板产生噬斑34

1.10.3 λ噬菌体来源的克隆载体的图谱34

1.11.2 基本方案2 噬菌体转染和体外包装35

1.12.1 基本方案 通过平板裂解制备噬菌体库36

1.12 培养λ衍生的噬菌体载体36

1.13.1 基本方案 通过分级平衡梯度离心制备DNA37

1.13 从噬菌体裂解液中制备λDNA37

1.12.2 备择方案 制备液体裂解物37

1.14 源于丝状噬菌体的载体39

基本方案 利用辅助噬菌体从质粒制备单链DNA42

1.15 M13噬菌体衍生载体的制备和应用42

第2章 DNA的制备和分析44

2.1 A水溶液中DNA的纯化和浓缩45

2.1A.3 辅助方案1 酚的平衡及酚／氯仿／异戊醇的配制46

2.1A.2 备择方案1 异丙醇沉淀DNA46

2.1A.1 基本方案 DNA的酚抽提和乙醇沉淀46

2.1A.4 辅助方案2 丁醇浓缩DNA47

2.1A.6 备择方案2 玻璃珠法纯化DNA48

2.1A.5 辅助方案3 醚抽提法去除残存酚、氯仿或丁醇48

2.1A.7 备择方案3 RNA及DNA稀溶液的纯化和浓缩49

基本方案50

2.1 B阴离子交换色谱法纯化DNA50

2.1A.8 备择方案4 乙醇沉淀法去除低分子量的寡核苷酸和核苷三磷酸50

基本方案52

2.2 从哺乳动物组织中制备基因组DNA52

2.3.1 基本方案 氯化铯离心法制备植物DNA53

2.3 从植物组织中制备基因组DNA53

2.3.2 备择方案 用CTAB制备植物DNA54

2.4.1 基本方案 细菌基因组DNA的小量制备55

2.4 从细菌中制备基因组DNA55

2.4.3 辅助方案 从所得到的基因组DNA制备物中除去多糖56

2.4.2 备择方案 氯化铯法大规模制备细菌基因组DNA56

2.5A.1 基本方案 大片段DNA在琼脂糖凝胶上的分离57

2.5A 琼脂糖凝胶电泳57

2.5A.2 辅助方案 微型凝胶及中型凝胶58

2.5B.1 基本方案 倒转电场凝胶电泳59

2.5B 脉冲场凝胶电泳59

2.5B.2 备择方案 钳位均匀电场电泳（CHEF电泳）60

2.5B.3 辅助方案 高分子量DNA样品和分子量标准物的制备61

2.6.1 基本方案1 琼脂糖凝胶电洗脱62

2.6 从琼脂糖凝胶中分离和纯化大的DNA限制性酶切片段62

2.6.2 基本方案2 NA-45纸电泳63

2.6.3 基本方案3 用低熔点琼脂糖凝胶分离DNA片段64

2.6.5 备择方案2 用玻璃珠法从低熔点琼脂糖凝胶中回收DNA65

2.6.4 备择方案1 使用β－琼脂糖酶消化法从低熔点琼脂糖凝胶中回收DNA65

2.7.1 基本方案1 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳66

2.7 用常规的凝胶电泳分离小分子DNA片段66

2.6.6 辅助方案 用溴化乙锭斑点定量法对DNA浓度进行快速估测66

2.7.3 基本方案2 筛分型琼脂糖凝胶电泳68

2.7.2 备择方案 通过电洗脱从聚丙烯酰胺凝胶纯化片段68

2.8 DNA的毛细管电泳69

2.8.1 基本方案1 寡核苷酸的分离72

2.8.3 备择方案 基因型分析74

2.8.2 基本方案2 定量PCR分析74

2.9A.1 基本方案 用高盐缓冲液在尼龙膜或硝酸纤维素膜上进行Southern印迹75

2.9A Southern印迹法75

2.9A.2 辅助方案 紫外透射仪的校准77

2.9A.4 备择方案2用向下毛细管转移法进行Southern杂交78

2.9A.3 备择方案1用碱性缓冲液在尼龙膜上进行Southern印迹78

2.9A.5 备择方案3从聚丙烯酰胺凝胶至尼龙膜的电转印法79

2.9B.1 基本方案 用多样抽滤加样器在不带电荷的尼龙膜和硝酸纤维素膜上进行DNA斑点和狭线印迹80

2.9B DNA的斑点和狭线印迹80

2.9B.2 备择方案1 用多样抽滤加样器在带正电荷的尼龙膜上进行DNA斑点和狭线印迹81

2.9B.3 备择方案2 DNA斑点印迹的手工制备82

2.10.1 基本方案 放射性标记的DNA探针对DNA印迹的杂交分析83

2.10 DNA印迹的杂交分析83

2.10.2 备择方案 用放射性标记的RNA探针对DNA印迹进行杂交分析87

基本方案89

2.11 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化寡核苷酸89

2.10.3 辅助方案 从杂交膜上除去探针89

第3章 DNA和RNA的酶学操作93

3.1.1 基本方案 单酶单DNA样品消化94

3.1 限制性内切酶消化DNA94

3.1.2 备择方案1 多限制性内切酶消化DNA样品97

3.1.5 辅助方案 DNA的甲基化98

3.1.4 备择方案3 限制性内切酶对DNA样品的部分消化98

3.1.3 备择方案2 消化多个DNA样品98

基本方案100

3.3 用限制酶部分消化进行DNA作图100

3.2 用多种酶消化进行DNA作图100

基本方案100

3.4.2 10×酶缓冲液101

3.4.1 贮液101

3.4 核酸操作的常用试剂和放射性同位素101

3.4.3 酶反应条件及应用103

3.4.4 核苷三磷酸（NTP）104

基本方案 酸沉淀法测定DNA和RNA中的放射性108

3.4.5 标记核酸的放射性同位素108

备择方案 柱离心法分离放射性标记DNA109

3.5 依赖于DNA的DNA聚合酶110

基本方案3 随机寡核苷酸引物介导的DNA标记112

基本方案2 修复突出的3′或5′末端以产生平端112

3.5.1 大肠杆菌DNA聚合酶IKlenow片段112

基本方案1 标记DNA的3′末端112

3.5.2 T4 DNA聚合酶113

3.5.3 天然T7噬菌体DNA聚合酶114

3.5.4 经修饰的T7噬菌体DNA聚合酶115

3.6 不依赖于模板的DNA聚合酶116

3.5.5 TaqDNA聚合酶116

3.7 依赖RNA的DNA聚合酶117

3.9 不依赖DNA的RNA聚合酶119

3.8 依赖DNA的RNA聚合酶119

3.10.2 T4噬菌体多核苷酸激酶120

3.10.1 碱性磷酸酶120

3.10 磷酸酶和激酶120

3.11.1 单链5′→3′和3′→5′外切核酸酶121

3.11 外切核酸酶121

基本方案1 正向反应标记5′端121

基本方案2 交换反应标记5′端121

3.11.3 双链3′→5′外切核酸酶122

3.11.2 双链5′→3′末端外切核酸酶122

3.12.2 S1核酸酶123

3.12.1 Bal31核酸酶123

3.12 内切核酸酶123

3.12.4 微球菌核酸酶124

3.12.3 绿豆核酸酶124

3.13.1 核糖核酸酶A（RNA酶A）125

3.13 核糖核酸酶125

3.12.5 脱氧核糖核酸酶I（DNA酶I）125

3.13.2 核糖核酸酶H126

3.14.2 大肠杆菌DNA连接酶127

3.14.1 T4噬菌体DNA连接酶127

3.13.3 核糖核酸酶T1127

3.14 DNA连接酶127

3.16.1 基本方案128

3.16 DNA片段的亚克隆128

3.15 RNA连接酶128

3.16.2 备择方案 凝胶块中DNA片段的连接130

基本方案 DNA片段亚克隆131

3.17 聚合酶链式反应构建重组DNA131

3.18.1 基本方案1 用切口平移法制备生物素酰化的探针135

3.18 非同位素探针的标记和比色检测135

3.18.2 基本方案2 用随机寡核苷酸引物合成法制备生物素酰化探针136

3.18.3 辅助方案 生物素酰化探针的比色法检测137

3.18.4 备择方案 制备和检测地高辛标记的DNA探针138

3.19.1 基本方案 生物素标记探针的化学发光检测139

3.19 非同位素探针的化学发光检测139

3.19.3 辅助方案 紫外光源的标化142

3.19.2 备择方案 地高辛标记探针的化学发光检测142

第4章 RNA的制备和分析144

4.1.1 基本方案145

4.1 从组织培养细胞中提取细胞质RNA145

4.1.2 辅助方案 除去混杂的DNA污染146

4.2.1 基本方案 从组织或培养细胞中一步法分离RNA147

4.2 异硫氰酸胍法制备总RNA147

4.2.2 备择方案1 CsCl法纯化从培养细胞中提取的RNA148

4.2.3 备择方案2 CsCl纯化组织RNA149

4.3 酚／SDS法制备植物RNA150

4.4.1 基本方案1 从革兰氏阴性细菌中分离高质量的RNA151

4.4 制备细菌RNA151

4.4.2 基本方案2 从革兰氏阳性细菌分离RNA153

4.5 poly(A)+RNA的制备154

4.4.3 备择方案 从革兰氏阴性菌中快速分离RNA154

4.6 用单链DNA探针进行mRNA的S1核酸酶作图分析155

4.6.1 基本方案 用M13模板进行mRNA的S1作图156

4.6.2 备择方案1 从双链模板合成单链探针158

4.6.3 备择方案2 用寡核苷酸探针进行mRNA的定量S1作图分析159

4.7.1 基本方案160

4.7 核酸酶保护试验160

4.6.4 辅助方案 S1核酸酶mRNA定量分析的实验对照160

4.7.3 辅助方案2 模板DNA的制备162

4.7.2 辅助方案1 RNA探针的提纯162

4.8 引物延伸163

4.9.1 基本方案 甲醛－琼脂糖凝胶电泳分离RNA的Northern杂交165

4.9 RNA的Northern印迹和狭线杂交分析165

4.9.2 备择方案1 经戊二醛／二甲基亚砜变性处理的RNA的Northern杂交168

4.9.3 备择方案2 经狭线印迹固定的未分级RNA样品的Northern杂交169

4.9.4 辅助方案 Northern Blot探针的除去170

第5章 重组DNA文库的构建172

5.1.2 亚基因组文库174

5.1.1 代表性与随机性174

5.1 基因组DNA文库概述174

5.2 cDNA文库概述175

5.1.3 基因组DNA文库载体175

基本方案176

5.3 噬菌体文库的扩增176

基本方案178

5.4 黏粒和质粒文库的扩增178

第6章 重组DNA文库的筛选179

6.1 噬菌体文库的铺平板和转移181

6.2 黏粒及质粒文库的铺平板和转移182

6.3.2 备择方案 在水溶液中杂交184

6.3.1 基本方案 在甲酰胺溶液中杂交184

6.3 应用DNA片段作探针184

6.4.1 基本方案1 在氯化钠／柠檬酸钠溶液（SSC）中杂交185

6.4 使用合成寡核苷酸作探针185

6.4.2 基本方案2 在氯化四甲铵（TMAC）中杂交186

6.4.3 辅助方案 混合寡核苷酸5′末端标记187

6.6 黏粒和质粒克隆的纯化189

6.5 噬菌体克隆的纯化189

6.7.1 基本方案 用抗体筛选λgt11表达文库190

6.7 在λ噬菌体噬斑中产生的融合蛋白的免疫筛选190

6.7.2 备择方案 在抗体筛选之前用IPTG诱导融合蛋白表达191

6.8 在杂交选择和翻译后进行的免疫筛选192

6.9.1 YAC文库的构建194

6.9 概述筛选YAC文库和分析YAC克隆的策略194

6.9.3 基因座特异性PCR试验的设计196

6.9.2 中心实验室的YAC文库筛选196

6.9.4 分析独立的YAC克隆197

6.10.1 基本方案1 含YAC的酵母菌株的培养和保存198

6.10 对分离得到的YAC克隆的分析198

6.9.5 YAC插入片段的亚文库的构建与分析198

6.10.2 基本方案2 制备YACDNA进行Southern印迹分析200

6.10.3 基本方案3 制备用于脉冲电场凝胶电泳的包埋于琼脂糖胶块中的酵母染色体201

6.10.4 基本方案4 用PCR扩增法进行末端片段分析202

6.10.5 备择方案 在细菌质粒载体中分析末端片段205

6.10.7 基本方案5 制备高分子质量的含YAC的酵母DNA207

6.10.6 辅助方案 设计和制备pUC19-ES和pUC19-HS亚克隆载体207

6.10.8 基本方案6 制备和分析YAC插入片段的亚文库209

7.0 DNA测序方法概述210

第7章 DNA序列测定210

7.0.1 双脱氧测序（Sanger法）211

7.0.2 化学测序（Maxam-Gilbert法）213

7.0.4 放射性标记测序反应的备择标记215

7.0.3 双脱氧法或化学测序法的选择215

7.1.1 双脱氧测序217

7.1 DNA测序策略217

7.1.2 化学测序219

7.2.1 基本方案1 用外切酶Ⅲ构建单向缺失突变体220

7.2 构建用于DNA测序的嵌套式缺失突变体220

7.2.2 辅助方案1 用［α-35S］dNTP使DNA免于外切酶Ⅲ消化224

7.2.3 基本方案2 用Bal31核酸酶构建嵌套式缺失突变体225

7.2.4 辅助方案2 制备M13mp测序载体以亚克隆Bal31消化的DNA片段229

7.3.1 基本方案1 制备单链M13噬菌体DNA230

7.3 制备DNA测序模板230

7.3.2 基本方案2 从小量裂解物中制备λ噬菌体DNA231

7.3.3 基本方案3 小量制备用于双脱氧测序的双链质粒DNA模板232

7.3.4 基本方案4 用于双脱氧测序的双链质粒DNA的碱变性233

7.4 双脱氧法DNA测序234

7.3.5 基本方案5 制备用于热循环测序质粒或噬菌体DNA234

7.4.1 基本方案1 用测序酶进行标记／终止测序反应235

7.4.3 备择方案2 使用TaqDNA聚合酶进行Sanger双脱氧测序239

7.4.2 备择方案1 使用Mn2+的标记／终止反应239

7.4.4 备择方案3 用5′末端标记引物一步法进行测序反应240

7.4.5 基本方案2 用α－标记核苷酸进行热循环测序反应241

7.4.7 备择方案5 使用荧光引物或荧光终止物进行循环测序244

7.4.6 备择方案4 用5′末端标记引物进行热循环测序反应244

7.5 化学发光双脱氧DNA测序法246

7.5.1 基本方案 利用生物素标记引物的化学发光DNA测序法248

7.5.2 备择方案1 链亲和素和生物素酰化碱性磷酸酶两步检测法（间接法）250

7.5.3 备择方案2 用半抗原标记引物进行测序并用抗体碱性磷酸酶偶联物进行检测251

7.6.1 基本方案 测序胶的灌制、电泳及处理252

7.6 用于测序的变性凝胶电泳252

7.6.2 备择方案1 缓冲液梯度测序胶255

7.6.3 备择方案2 电解质梯度测序胶256

7.7.1 序列数据的录入257

7.7 DNA和蛋白质序列的计算机处理和分析257

7.6.4 备择方案3 含甲酰胺的测序胶257

7.7.2 序列数据的确证和组装260

7.7.3 限制酶作图263

7.7.4 核酸结构预测264

7.7.5 寡核苷酸设计策略265

7.7.6 蛋白质编码区的识别267

7.7.7 同源性检索268

7.7.8 向分子生物学提供的基因序列库及其他计算机资源271

第8章 克隆化DNA的诱变279

8.1 无需表型选择的寡核苷酸介导的诱变280

8.2A 用简并寡核苷酸在小段DNA序列中产生大量突变283

8.2B 基因合成：用互为引物的长段寡核苷酸合成目的序列286

8.3.1 基本方案287

8.3 区域特异性诱变287

8.4.1 基本方案 用嵌套缺失体和互补寡核苷酸进行接头分区诱变290

8.4 DNA的接头分区诱变290

8.3.2 辅助方案 突变克隆的富集290

8.4.2 备择方案 寡核苷酸介导的接头分区诱变292

8.5.1 基本方案1 通过PCR引入限制酶切位点293

8.5 利用聚合酶链反应（PCR）的定点诱变293

8.5.2 基本方案2 利用PCR引入点突变296

8.5.3 备择方案 通过连续PCR引入点突变299

第9章 DNA导入哺乳动物细胞300

9.1.1 基本方案 磷酸钙－DNA在HEPES中形成沉淀的转染方法305

9.1 磷酸钙转染法305

9.1.2 辅助方案 哺乳动物细胞的甘油／二甲基亚砜休克306

9.1.3 备择方案 在BES中形成磷酸钙－DNA沉淀的高效转染方法307

9.2.1 基本方案 DEAE－葡聚糖转染法的基本操作程序308

9.2 利用DEAE－葡聚糖的转染308

9.2.2 备择方案 样本实验：用以检测酶的结构／活性关系的转染310

9.3.1 基本方案 电穿孔法转染哺乳动物细胞311

9.3 电穿孔转染法311

9.2.3 辅助方案 炭吸附胎牛血清311

9.3.2 备择方案 植物原生质体细胞的电穿孔转染312

9.4.1 基本方案 用脂质体介导短暂表达313

9.4 脂质体介导的转染313

9.5 被转染哺乳动物细胞的选择314

9.4.2 备择方案 用脂质体进行稳定转染314

9.5.1 基本方案1 哺乳动物细胞的稳定转染316

9.5.2 基本方案2 哺乳动物细胞的选择标记318

9.6 遗传报道基因系统概述322

9.6.1 报道载体的设计323

9.6.2 体外报道分子分析方法326

9.6.3 体内报道分子分析方法329

9.7A.1 基本方案1 CAT活性的色谱分析法331

9.7A 报道基因活性的同位素分析方法331

9.7A.3 备择方案2 CAT活性的相－抽提分析法333

9.7A.2 备择方案1 原位裂解细胞的CAT分析方法333

9.7A.4 基本方案2 人生长激素的放射免疫分析法334

9.7B.1 基本方案1 萤火虫萤光素酶报道基因分析336

9.7B 非同位素分析报道基因活性336

9.7B.3 基本方案2 β－半乳糖苷酶报道基因的化学发光分析337

9.7B.2 备择方案 冻融裂解的细胞的萤光素酶分析337

9.8.1 反转录病毒生活周期339

9.8 反转录病毒转导系统概述339

10.2.7 备择方案5 在梯度凝胶中分离蛋白质340

9.8.2 无复制能力的载体341

9.8.3 有复制能力的载体343

9.8.4 包装细胞系和病毒的产生344

9.8.5 鼠反转录病毒348

9.8.7 安全性问题350

9.8.6 禽反转录病毒350

9.9.1 基本方案1 将反转录病毒载体导入包装细胞系351

9.9 建立特异的反转录病毒产毒细胞系351

9.9.2 基本方案2 测定病毒滴度：高滴度产病毒细胞克隆的鉴定353

9.10 制备高滴度反转录病毒上清的瞬时转染方法355

9.9.3 备择方案 产毒克隆的快速评价355

9.9.4 辅助方案 培养细胞的Xgal染色355

9.10.1 基本方案1 将反转录病毒载体瞬时转染入293细胞系356

9.10.2 辅助方案 293细胞的生长和保存357

9.10.3 基本方案2 用反转录病毒上清感染贴壁细胞358

9.10.5 基本方案3 用反转录病毒上清感染非贴壁细胞359

9.10.4 备择方案1 旋转感染法感染贴壁细胞359

9.10.6 备择方案2 共培养感染非贴壁细胞360

9.10.7 备择方案3 旋转感染法感染非贴壁细胞361

9.11.1 基本方案 用离心法制备和浓缩病毒原液362

9.11 大规模制备和浓缩反转录病毒原液362

9.11.2 备择方案1 用聚乙二醇沉淀及层析法浓缩病毒363

9.12.1 基本方案 通过药物抗性的水平传播分析辅助病毒364

9.11.3 备择方案2 用分子质量截留滤膜进行浓缩364

9.12 反转录病毒原液中辅助病毒的检测364

9.12.2 备择方案1 用原病毒检测具复制能力的反转录病毒365

9.13.1 体外细胞感染367

9.12.3 备择方案2 用反转录酶分析法检测辅助病毒367

9.13 用反转录病毒在体外及体内感染细胞367

9.13.2 在体内感染啮齿类动物368

第10章 蛋白质分析370

10.1.2 基本方案2 应用Bradford法测定蛋白浓度377

10.1 蛋白浓度测定377

10.1.1 基本方案1 应用A280来测定蛋白浓度377

10.2 蛋白质的单向SDS凝胶电泳378

10.2.1 基本方案1 变性（SDS）不连续凝胶电泳：Laemmli凝胶法379

10.2.2 备择方案1 Tris-Tricine缓冲液系统的电泳383

10.2.3 备择方案2 在无尿素条件下用Tris缓冲液分离多肽385

10.2.4 备择方案3 连续SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳386

10.2.5 备择方案4 超薄凝胶的灌制和电泳387

10.2.6 辅助方案1 一次灌制多块浓度均一的凝胶388

10.2.8 辅助方案2 一次灌制多块梯度胶393

10.2.9 基本方案2 在均一浓度的微型凝胶上电泳395

10.2.10 辅助方案3 制备多块梯度胶397

10.3.1 基本方案1 第1向凝胶（等电聚焦）398

10.3 使用O'Farrell系统的双向凝胶电泳398

10.3.2 基本方案2 第2向凝胶400

10.3.3 极端碱性、酸性蛋白的等电聚焦402

10.4 凝胶中蛋白的染色403

10.3.5 辅助方案 组织来源的蛋白样品的溶解和制备403

10.3.4 备择方案 小型凝胶两向电泳403

10.4.2 基本方案2 银染法404

10.4.1 基本方案1 考马斯亮蓝染色404

10.4.3 备择方案 非氨盐银染法405

10.4.4 基本方案3 快速银染法406

10.5.1 基本方案1 用转移槽转印蛋白质407

10.5 免疫印迹和免疫检测407

10.4.5 辅助方案 凝胶拍照407

10.5.2 备择方案1 用半干转移系统转印蛋白质409

10.5.5 基本方案2 用第二抗体偶联物进行免疫检测411

10.5.4 辅助方案1 转印后蛋白质的可逆染色411

10.5.3 备择方案2 染色凝胶的印迹411

10.5.6 备择方案3 用亲和素－生物素偶联的第二抗体进行免疫检测413

10.5.7 基本方案3 用发色底物显迹414

10.5.8 备择方案4 用发光底物显迹415

10.6.1 基本方案1 脱盐（组分分离）416

10.6 凝胶过滤层析416

10.5.9 辅助方案2 膜的清洗和再使用416

10.6.2 基本方案2 蛋白质的分级分离421

10.6.3 基本方案3 分子质量的测定425

10.6.4 辅助方案 柱校正427

10.7.1 基本方案1 批式吸附和增加盐浓度的阶段梯度洗脱429

10.7 离子交换层析429

10.7.2 基本方案2 线性梯度洗脱的柱层析432

10.7.3 辅助方案 进行小试确定离子交换层析的起始条件435

10.8.1 基本方案 可溶性或膜结合抗原的分离439

10.8 免疫亲和层析439

10.8.2 备择方案1 抗原的批式纯化441

10.9 金属螯合亲和层析442

10.8.3 备择方案2 低pH洗脱抗原442

10.9.1 基本方案 天然MCAC纯化对组氨酸加尾的可溶性融合蛋白443

10.9.2 备择方案1 变性条件下用MCAC纯化带组氨酸尾的不溶性融合蛋白445

10.9.4 辅助方案 NTA介质的再生446

10.9.3 备择方案2 MCAC纯化蛋白的固相复性446

10.10.1 基本方案1 5-500PMOL水平的反相肽分离447

10.10 肽的反相分离447

10.10.3 辅助方案 毛细管HPLC系统的装配449

10.10.2 基本方案2 不超过于5 pmol的反相肽分离449

10.11 通过表位标签纯化重组蛋白450

基本方案 带表位标签重组蛋白的免疫沉淀452

10.12.1 基本方案 用抗体－Sepharose偶联物免疫沉淀放射性标记抗原454

10.12 免疫沉淀454

10.12.2 辅助方案 制备抗体－Sepharose偶联物455

10.12.4 备择方案2 用抗Ig抗体－Sepharose、蛋白A－或蛋白G-Sepharose或金黄色葡萄球菌（S.aureus）免疫沉淀放射性标记抗原457

10.12.3 备择方案1 用抗Ig血清免疫沉淀放射性标记抗原457

10.12.6 备择方案4 用抗体－Sepharose琼脂糖偶联物免疫沉淀非标记抗原458

10.12.5 备择方案3 使用更剧烈的解离和洗涤条件的免疫沉淀458

10.13 克隆化基因的体外转录和翻译459

10.14 氨基酸代谢标记461

10.14.1 基本方案 ［35S］标记甲硫氨酸对悬浮培养细胞的脉冲标记462

10.14.3 备择方案2 ［35S］甲硫氨酸脉冲示踪标记细胞463

10.14.2 备择方案1 贴壁细胞的［35S］甲硫氨酸脉冲标记463

10.14.4 备择方案3 ［35S］甲硫氨酸的长期细胞标记464

10.14.5 备择方案4 用其他放射性标记的氨基酸进行代谢标记465

10.14.6 辅助方案 TCA沉淀法来测定所标记掺入量466

10.15.1 基本方案1 测定在PVDF膜上样品的氨基酸序列467

10.15 分离蛋白质用于微量序列分析467

10.15.3 基本方案2 测定N端封闭蛋白质的内部序列469

10.15.2 辅助方案 准备SDS-PAGE蛋白质样品469

第11章 免疫学472

11.1.1 基本方案 辣根过氧化物酶HRPO与抗体的偶联474

11.1 酶与抗体的偶联474

11.2 酶联免疫吸附分析（ELISA）475

11.1.2 备择方案 碱性磷酸酶与抗体的偶联475

11.2.1 基本方案 间接ELISA法检测特异性抗体476

11.2.2 备择方案1 直接竞争ELISA法检测可溶性抗原477

11.2.3 备择方案2 抗体夹心ELASA法检测可溶性抗原479

11.2.4 备择方案3 双抗体夹心ELISA检测特异性抗体480

11.2.5 备择方案4 直接细胞ELISA法检测细胞表面抗原481

11.2.6 备择方案5 间接细胞ELISA法检测对表面抗原具有特异性的抗体482

11.2.7 辅助方案1 正交连续稀释法确定最佳试剂浓度483

11.2.8 辅助方案2 制备细菌裂解物抗原484

11.3.1 基本方案1 单克隆抗体上清的制备485

11.3 单克隆抗体上清液和腹水的制备485

11.3.2 备择方案1 单克隆抗体上清的大量制备486

11.3.3 备择方案2 大量制备杂交瘤或细胞系487

11.3.4 基本方案2 含单克隆抗体的腹水的制备488

11.4.1 基本方案 用蛋白A-Sepharose进行纯化489

11.4 单克隆抗体的纯化489

11.4.2 备择方案1 蛋白A-Sepharose的备择缓冲液系统490

11.4.3 备择方案2 用抗原－Sepharose和抗鼠Ig-Sepharose进行纯化491

11.5.1 基本方案 肌肉内注射免疫法492

11.5 兔多克隆抗血清的制备492

11.5.2 备择方案1 皮内注射免疫法493

11.5.4 备择方案3 耳动脉放血494

11.5.3 备择方案2 皮下注射免疫法494

11.6.2 备择方案 用DEAE-Affi-GelBlue层析法分级分离IgG495

11.6.1 基本方案 用硫酸铵沉淀IgG495

11.6 从抗血清、腹水或杂交瘤上清液中纯化IgG抗体495

11.7 免疫原性肽的选择496

11.8.1 基本方案 通过化学偶联法用MBS将合成肽偶联到载体蛋白上去498

11.8 抗肽抗体的制备498

11.8.2 备择方案 用戊二醛将合成肽通过化学偶联法交联到载体蛋白质上499

第12章 DNA－蛋白质相互作用501

12.1.1 基本方案 核提取物的制备503

12.1 从哺乳动物细胞中制备核提取物和细胞质提取物503

12.1.2 辅助方案1 细胞核提取方法的优化505

12.2 DNA结合蛋白在凝胶电泳中的迁移率变动分析506

12.1.3 辅助方案2 细胞质（S-100）组分的制备506

12.2.1 基本方案 迁移率变动分析507

12.2.2 备择方案1 竞争迁移率变动分析509

12.2.4 备择方案3 多元变动分析510

12.2.3 备择方案2 抗体超变动分析510

12.3.1 基本方案1 甲基化干扰分析法511

12.3 甲基化干扰分析法和尿嘧啶干扰分析法511

12.3.2 基本方案2 尿嘧啶干扰分析法512

12.4 DNA酶I足迹分析法514

12.4.1 基本方案 DNA酶I足迹分析法515

12.4.2 辅助方案 用光密度及数值分析法决定蛋白质结合的平衡常数517

12.4.3 辅助方案 粗制品的DNA酶I足迹分析法519

12.5.1 基本方案 用溴脱氧尿苷（BrdU）取代的探针进行紫外交联520

12.5 蛋白质与核酸的紫外交联520

12.5.3 备择方案2 原位紫外交联523

12.5.2 备择方案1 用非溴脱氧尿苷（BrdU）取代的探针进行紫外交联523

12.6.1 基本方案524

12.6 用生物素／链亲和素亲和系统纯化DNA结合蛋白524

12.6.2 备择方案1 用微型柱进行纯化525

12.6.3 备择方案2 用链亲和素－琼脂糖进行纯化526

12.7.1 基本方案 用识别位点DNA筛选λgt11表达文库527

12.7 编码DNA结合蛋白的cDNA的检测、纯化和鉴定527

12.7.2 备择方案 干燥膜的变性／复性529

12.7.3 辅助方案 从重组溶原菌中制备粗提物鉴定DNA结合蛋白的活性530

基本方案531

12.8 用体外合成的蛋白质分析DNA蛋白质相互作用531

12.9.1 基本方案1 DNA亲和介质的制备532

12.9 序列特异性DNA结合蛋白的亲和层析纯化532

12.9.3 辅助方案1 用制备性凝胶电泳纯化寡核苷酸535

12.9.2 备择方案 将DNA偶联于溴化氰活化的琼脂糖上535

12.9.4 基本方案2 DNA亲和层析法537

12.9.5 辅助方案2 非同位素竞争性DNA的选择和制备539

12.10.1 基本方案540

12.10 PCR辅助结合位点选择确定蛋白质－DNA序列特异性540

12.10.2 备择方案 从迁移率变动凝胶中分离和分析结合的寡核苷酸544

第13章 酿酒酵母545

13.1 酵母菌培养基的制备546

13.1.1 液体培养基547

13.1.2 固体培养基550

13.2 酵母菌的培养与操作552

13.1.3 菌株的保存与复苏552

13.2.4 基本方案4 影印平板检测酵母菌表型553

13.2.3 基本方案3 细胞密度检测553

13.2.1 基本方案1 液体培养基培养酵母菌553

13.2.2 基本方案2 固体培养基培养酵母菌553

13.2.6 基本方案6 二倍体细胞的孢子形成554

13.2.5 基本方案5 二倍体细胞的构建554

13.2.7 基本方案7 四分体的制备与剖分555

13.2.8 辅助方案 解剖针的制作557

13.2.9 备择方案 随机孢子分析558

13.3.1 基本方案 乙基甲磺酸诱变559

13.3 酵母菌细胞的诱变559

13.3.2 备择方案 紫外光诱变560

13.4 酵母菌的克隆载体与基因561

13.4.1 质粒分类命名563

13.4.2 精选的质粒和基因图谱564

13.5 酵母菌表达载体571

13.6.1 基本方案1 研究基因调控的LacZ融合载体574

13.6 酵母菌载体与表达产物的检测574

13.6.2 基本方案2 β－半乳糖苷酶在液体培养基中的表达与检测575

13.7 将DNA导入酵母菌细胞中576

13.6.3 备择方案 利用滤纸提取检测法筛选表达β－半乳糖苷酶的酵母菌落576

13.7.1 基本方案 乙酸锂转化577

13.7.2 备择方案1 原生质体转化578

13.7.3 备择方案2 电穿孔转化580

13.7.4 辅助方案 单链高分子量载体DNA的制备581

基本方案582

13.8 利用互补作用克隆酵母菌基因582

13.9.2 基本方案2 质粒缺口修复584

13.9.1 基本方案1584

13.9 从酵母细胞中分离除去质粒584

13.9.3 基本方案3 穿梭质粒585

13.10.2 基因置换技术587

13.10.1 基本方案1 整合性转化587

13.10 克隆化酵母DNA的操作587

备择方案1 PCR介导的基因一步破坏法588

基本方案3 基因破坏一步法588

基本方案2 整合性破坏588

基本方案4 移换590

13.10.3 基本方案5 一步整合置换产生修饰基因591

13.10.5 基本方案6 通过铜诱导双重关闭技术产生条件表达的等位基因592

13.10.4 备择方案2 通过移换产生修饰基因592

13.11 酵母DNA的制备594

13.11.2 备择方案 酵母染色体DNA的快速分离595

13.11.1 基本方案 从酵母菌中快速分离质粒DNA595

13.12.1 基本方案 热酸性酚抽提法制备酵母RNA596

13.12 酵母菌RNA的制备596

13.12.2 备择方案1 玻璃珠制备RNA597

13.13 制备酵母蛋白抽提物598

13.12.3 备择方案2 poly(A)+RNA的制备598

13.13.1 基本方案 原生质球制备及裂解599

13.13.2 辅助方案 差速离心法制备细胞核600

13.13.4 备择方案2 液氮破细胞法601

13.13.3 备择方案1 玻璃珠破细胞法601

14.1 组织、胚胎及单细胞的固定、包埋及切片603

第14章 原位杂交和免疫组织化学603

14.1.1 基本方案 组织和胚胎的多聚甲醛固定及石蜡包埋604

14.1.3 辅助方案1 成年小鼠的灌注605

14.1.2 备择方案 悬浮及培养细胞的PFA固定605

14.1.4 辅助方案2 蜡块中样品的切片606

14.1.5 辅助方案3 预包被载玻片的处理607

14.2 冰冻切片608

14.2.1 基本方案 样品制备及切片609

14.2.2 辅助方案1 用于原位杂交的冰冻切片的固定611

14.3 细胞RNA的原位杂交612

14.2.3 辅助方案2 组织固定和蔗糖灌注612

14.3.1 基本方案 石蜡切片或细胞的杂交实验613

14.3.2 备择方案 冰冻切片的杂交实验616

14.3.3 辅助方案1 35S标记的核糖核酸探针和含硫探针竞争剂的合成617

14.4.2 基本方案2 胶乳放射自显影619

14.4.1 基本方案1 胶片放射自显影619

14.3.4 辅助方案2 35S标记的双链DNA探针的合成619

14.4 杂交探针的检测619

14.4.3 辅助方案 放射自显影用稀释胶乳的制备620

14.5.1 基本方案 吉姆萨（Giemsa）染色621

14.5 放射自显影原位杂交玻片的复染和压片固定621

14.5.2 备择方案1 苏木精／伊红染色622

14.5.4 备择方案3 HOECHST染色法623

14.5.3 备择方案2 甲苯胺蓝染色623

14.6 免疫组织化学法624

14.6.2 备择方案1 悬浮细胞的免疫荧光标记626

14.6.1 基本方案1 单层生长细胞的免疫荧光标记626

14.6.3 基本方案2 组织切片的免疫荧光标记627

14.6.4 备择方案2 链亲和素－生物素结合物免疫荧光标记法628

14.6.6 备择方案4 组织切片的免疫过氧化物酶标记629

14.6.5 备择方案3 组织切片的免疫金标记629

14.7.1 基本方案 荧光原位杂交630

14.7 用非同位素进行原位杂交和检测630

14.6.7 备择方案5 组织切片的免疫荧光双标记法630

14.7.2 杂交信号的放大632

14.7.3 非同位素标记探针的酶法检测634

14.8.1 总体设计637

14.8 低丰度核酸的检测：原位PCR和杂交637

14.8.2 基本方案1 DNA和RNA靶序列的原位PCR扩增640

14.8.3 备择方案 一步法反转录及扩增643

14.8.4 基本方案2 ISPCR扩增的产物的杂交和检测644

14.8.6 辅助方案2 在载玻片上制备原位PCR样品648

14.8.5 辅助方案1 AES浸泡处理载玻片的制备648

14.8.7 辅助方案3 用33P标记寡核苷酸探针649

第15章 聚合酶链式反应（PCR）651

基本方案652

15.1 PCR扩增DNA：标准程序和优化652

15.2.2 备择方案1 单引物重复扩增制备单链模板以用于双脱氧测序658

15.2.1 基本方案1 不对称PCR产生的单链产物的双脱氧测序658

15.2 利用PCR产物直接进行DNA序列测定658

15.2.3 备择方案2 制备用于双脱氧测序的双链PCR产物659

15.2.5 基本方案2 PCR产物的标记和化学测序660

15.2.4 备择方案3 用λ噬菌体核酸外切酶消化双链PCR产物得到单链进行双脱氧测序660

15.2.6 备择方案4 PCR产物的基因组测序661

基本方案662

15.3 通过PCR方法对微量DNA进行定量分析662

15.4.1 基本方案 在最适条件下进行RNA的PCR扩增665

15.4 PCR扩增RNA665

15.4.2 备择方案1 避免长时间的共沉淀及退火步骤的方法666

15.5 用于基因组测序及足迹分析的连接介导PCR667

15.4.4 辅助方案 粗制RNA的快速提取667

15.4.3 备择方案2 将cDNA直接用于扩增反应667

15.5.1 基本方案 连接介导的单侧PCR669

15.5.2 辅助方案1 从单层细胞制备基因组DNA以用于DMS足迹分析672

15.5.3 辅助方案2 从悬浮细胞中制备用于DMS足迹分析的基因组DNA675

15.5.4 辅助方案3 用于化学测序的基因组DNA的制备676

15.6 利用单侧PCR（锚式PCR）进行cDNA扩增677

15.6.1 基本方案1 扩增已知序列的下游（3′端）区段679

15.6.2 基本方案2 扩增已知序列上游（5′端）区段681

15.7.1 基本方案 产生T-A突出端683

15.7 PCR产物的分子克隆683

15.7.2 备择方案 产生半位点684

15.8 通过PCR差异显示mRNA686

第16章 蛋白质的表达692

16.1 概述：蛋白质在大肠杆菌中的表达693

16.1.2 特定的表达方案694

16.1.1 用大肠杆菌进行基因表达的一般策略694

16.1.3 基因表达的疑难分析695

16.2.1 基本方案 用双质粒系统进行表达696

16.2 T7噬菌体RNA聚合酶／启动子表达系统696

16.2.2 备择方案1 质粒编码蛋白的选择性标记698

16.2.3 备择方案2 通过M13噬菌体mGP1-2感染的表达699

16.3 融合蛋白载体表达概述700

16.4.1 基本方案1 用Xa因子进行融合蛋白的酶解702

16.4 融合蛋白的酶解和化学裂解702

16.4.3 备择方案1 用凝血酶进行融合蛋白的酶解703

16.4.2 辅助方案 用Xa因子进行变性融合蛋白的裂解703

16.4.4 备择方案2 与分离介质结合的GST融合蛋白的酶解704

16.4.5 备择方案3 用肠激酶进行融合蛋白的酶解705

16.4.6 基本方案2 用溴化氰对融合蛋白进行化学降解706

16.4.8 备择方案5 低pH下水解融合蛋白进行化学裂解707

16.4.7 备择方案4 用羟胺化学裂解融合蛋白707

16.5 麦芽糖结合蛋白融合蛋白的表达及纯化708

16.5.1 基本方案 MBP融合蛋白的构建、表达和纯化709

16.5.2 辅助方案1 应用预实验鉴定MBP融合蛋白的特性711

16.5.4 辅助方案2 离子交换层析纯化裂解蛋白713

16.5.3 备择方案 从外周胞质中纯化融合蛋白713

16.5.5 辅助方案3 亲和层析纯化裂解蛋白714

16.6 谷胱甘肽－S－转移酶融合蛋白的表达及纯化715

16.7.1 基本方案 硫氧还蛋白融合蛋白的构建和表达718

16.7 硫氧还蛋白融合蛋白的表达和纯化718

16.7.2 辅助方案1 用弗氏细胞压碎器裂解大肠杆菌721

16.7.4 辅助方案3 用热处理纯化硫氧还蛋白融合蛋白723

16.7.3 辅助方案2 硫氧还蛋白融合蛋白的渗透性释放723

16.8 杆状病毒表达系统的概述724

16.8.1 杆状病毒表达系统725

16.8.3 用杆状病毒表达系统超量表达蛋白的步骤726

16.8.2 昆虫细胞中蛋白质的翻译后修饰726

16.8.4 选择杆状病毒转移载体727

16.8.5 选择杆状病毒DNA729

16.8.6 用于杆状病毒表达系统的试剂、溶液和设备730

16.9.1 基本方案1 昆虫细胞的保存和培养731

16.9 昆虫细胞培养的保存及重组杆状病毒的产生731

16.9.2 基本方案2 用线性化杆状病毒DNA共转染昆虫细胞733

16.9.3 备择方案 用野生型杆状病毒DNA共转染产生重组病毒734

16.9.4 基本方案3 杆状病毒毒种贮液的制备737

16.9.5 基本方案4 用蚀斑试验测定病毒贮液的滴度738

16.10.1 基本方案1 用于最初分析的小规模表达740

16.10 杆状病毒系统表达和纯化重组蛋白740

16.10.2 辅助方案1 蛋白质生产高峰期的确定741

16.10.3 辅助方案2 重组蛋白质的代谢标记742

16.10.4 基本方案2 重组蛋白质的大规模生产743

16.10.5 基本方案3 含有多聚组氨酸（6×His）标签重组蛋白的纯化744

16.10.6 备择方案 含有GST标签重组蛋白的纯化745

16.11.1 病毒介导的基因转移747

16.11 概述：蛋白质在哺乳动物细胞中表达747

16.11.3 DNA的稳定转染748

16.11.2 短暂表达748

16.11.4 转染DNA的扩增749

16.11.7 问题的发现与解决750

16.11.6 表达系统的选择750

16.11.5 表达载体750

16.12 用COS细胞短暂表达蛋白质751

16.13 痘苗病毒表达系统概述753

16.13.1 痘苗病毒的生活周期754

16.13.3 痘苗病毒表达载体系统755

16.13.2 痘苗病毒感染的效应755

16.13.5 痘苗病毒的安全性问题756

16.13.4 痘苗病毒载体表达基因的步骤756

16.14.1 基本方案1 贴壁细胞的培养757

16.14 细胞系和痘苗病毒贮液的制备757

16.14.2 基本方案2 悬浮细胞的培养759

16.14.3 基本方案3 痘苗病毒贮液的制备760

16.14.5 基本方案4 鸡胚成纤维细胞的制备761

16.14.4 辅助方案1 蚀斑分析测定痘苗病毒贮液的滴度761

16.14.6 基本方案5 MVA病毒贮液的制备763

16.14.7 辅助方案2 用免疫染色法滴定MVA病毒764

16.15.1 基本方案1 痘苗载体转染痘苗病毒感染的细胞765

16.15 重组痘苗病毒的制备765

16.15.2 辅助方案1 痘苗病毒的纯化769

16.15.3 辅助方案2 痘苗病毒DNA的提取771

16.15.4 基本方案2 筛选重组病毒蚀斑772

16.15.5 基本方案3 蚀斑扩增774

16.15.6 基本方案4 重组MVA的活体免疫染色775

16.15.7 辅助方案3 用刀豆蛋白A包被组织培养板776

16.16 重组痘苗病毒及其产物的鉴定777

16.16.1 基本方案1 应用PCR方法检测痘苗病毒778

16.16.2 基本方案2 应用Southern杂交检测痘苗病毒DNA780

16.16.3 基本方案3 应用斑点杂交检测痘苗病毒DNA781

16.16.4 备择方案 应用斑点印迹检测表达的蛋白782

16.16.5 基本方案4 应用免疫印迹检测表达的蛋白782

16.16.6 基本方案5 应用免疫沉淀检测表达的蛋白784

16.17 用痘苗病毒／T7RNA聚合酶系统表达基因784

16.17.1 基本方案1 重组痘苗病毒（vTF7-3）感染后的脂质体转染785

16.17.2 基本方案2 两种重组痘苗病毒共感染细胞787

16.17.3 基本方案3 单病毒感染OST7-1细胞788

16.17.4 基本方案4 利用VOTE系统进行基因表达789

16.17.5 辅助方案 脉冲标记检测表达的蛋白791

16.18 自主调节的四环素控制基因的诱导表达系统792

16.18.1 基本方案 磷酸钙介导的pTet-tTAK稳定转染NIH3T3细胞和四环素调控的靶质粒792

16.18.2 辅助方案 分析目的基因的蛋白质表达796

16.18.3 转基因鼠的细胞或尾巴DNA中tTA基因的PCR检测796

16.18.4 转基因鼠的细胞或尾巴DNA中tTA基因Southern印迹检测797

第17章 蛋白质磷酸化的分析798

17.1 蛋白质磷酸化概述798

17.2 培养细胞用32Pi标记和用于免疫沉淀的细胞裂解物的制备799

17.2.1 基本方案 培养细胞的32Pi标记和温和去污剂裂解法800

17.2.2 备择方案 SDS煮沸法裂解细胞801

17.3 磷酸氨基酸分析802

17.3.1 基本方案 磷酸氨基酸的酸水解和双向电泳分析802

17.4 分析非标记蛋白质的磷酸化作用806

17.4.1 基本方案1 用抗磷酸酪氨酸抗体和125I标记蛋白A进行免疫印迹分析806

17.3.2 备择方案 碱处理提高转移至滤膜上的磷酸化酪氨酸和磷酸苏氨酸的检测806

17.4.2 备择方案 用增强化学发光法（ECL）检测结合的抗体807

17.4.3 基本方案2 磷酸酶消化法鉴定磷酸化的蛋白质808

17.5 酶法检测磷酸化作用810

17.5.1 基本方案1 用非特异酸性磷酸酶消化磷酸蛋白质810

17.5.2 备择方案1 用非特异碱性磷酸酶消化磷酸蛋白质811

17.5.3 基本方案2 用丝氨酸／苏氨酸磷酸酶消化磷酸蛋白质811

17.5.4 备择方案2 用酪氨酸磷酸酶消化磷酸蛋白质812

17.5.5 辅助方案离解32P的测量和确定812

17.6 用外源性底物分析蛋白激酶813

17.6.1 基本方案1 环磷酸核苷依赖性蛋白激酶的分析815

17.6.2 基本方案2 蛋白激酶C异构体的分析816

17.6.3 基本方案3 用β－酪蛋白进行酪蛋白激酶的分析816

17.6.4 备择方案 用多肽底物进行酪蛋白激酶的分析817

17.6.5 基本方案4 Ca2+／钙调蛋白－依赖性激酶的分析818

17.6.6 基本方案5 酪氨酸激酶的分析818

17.6.7 基本方案6 在凝胶中直接进行激酶的分析819

17.6.8 辅助方案1 用于激酶分析的细胞裂解方案821

17.6.9 辅助方案2 三氯乙酸沉淀法测定放射性物质的掺入率821

17.6.10 辅助方案3 P81磷酸纤维素膜的吸附822

17.7 研究蛋白磷酸化的渗透策略823

17.7.1 基本方案 利用渗透化细胞进行蛋白磷酸化的分析824

17.7.2 制备用于蛋白磷酸化电泳分析的天然细胞样品826

17.7.3 备择方案1 用于SDS-PAGE的天然细胞样品制备826

17.7.4 备择方案2 制备用于等电聚焦的天然细胞样品827

18.1 用BLAST程序组进行序列相似性搜索828

18.1.1 BLAST程序组和说明文件828

第18章 生物信息学828

18.1.2 BLAST概述829

18.1.3 BLAST搜索的举例832

18.1.4 搜索策略846

18.1.5 附录A：BLAST参数849

18.1.6 附录B：序列标识的句法849

第19章 蛋白质相互作用的分析851

19.1 利用相互作用阱／双杂合系统确定相互作用的蛋白质854

19.1.1 基本方案1 鉴定诱饵蛋白的特性854

19.1.2 基本方案2 相互作用蛋白的捕获861

19.1.3 备择方案1 相互作用阱的快速筛选867

19.1.4 备择方案2 通过相互作用交配进行捕获实验868

19.1.5 辅助方案1 用于免疫印迹分析的蛋白质提取物的制备871

19.1.6 辅助方案2 制备鲑精载体DNA871

19.2 与GST融合蛋白结合的蛋白质的亲和纯化873

19.2.1 GST融合蛋白的亲和纯化873

19.2.2 辅助方案 E.coli提取物的制备875

19.3 基于噬菌体表达克隆来确认相互作用蛋白质876

19.3.1 设计策略877

19.3.2 基本方案 相互作用克隆877

附录881

附录1 试剂和溶液881

附录2 标准测量值和数据999

附录3 生物化学和分子生物学常用技术1018

附录3A 放射自显影1018

附录3B 玻璃器皿的硅化1020

附录3C 透析与超滤1021

附录3D 用吸收光谱法和荧光光谱法定量DNA和RNA1026

附录3E 通过沉默突变引入限制性酶切位点1028

附录3F 哺乳动物细胞组织培养技术1031

附录3G 安全使用放射性同位素1038

附录3H 分子生物学家的统计学：组比较1047

附录4 试剂和设备的供应商1069

附录5 参考文献1091

索引1100