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第一篇　细胞培养基本技术1

第一章 细胞培养的基本知识1

第一节　基本概念和名词1

第二节　细胞的特性3

一、培养细胞的形态与结构3

二、培养细胞的生长方式和类型5

三、培养细胞的生长特点和生长增殖过程5

第二章 细胞培养的条件10

第一节　细胞的营养10

一、水10

二、糖11

三、氨基酸11

四、维生素12

五、无机离子和微量元素12

六、血清13

七、促细胞生长因子14

第二节　影响细胞生长的因素15

一、温度15

二、渗透压15

三、气体环境和pH值16

四、无毒和无菌17

五、辐射线和超声波17

六、细胞接种密度17

七、容器转动速度和悬浮搅动速度18

第三章 细胞培养的必备设施、常用器材和培养基19

第一节　细胞培养的必备设施19

一、无菌实验室19

二、超净工作台19

三、恒温培养箱20

四、其他设备20

第二节　细胞培养常用器材及处理方法21

一、玻璃器材22

二、塑料器材23

三、橡胶器材23

四、金属器材24

五、其他用品24

第三节　常用溶液、培养基及其配制25

一、平衡盐溶液25

二、其他溶液26

三、培养基27

第四章 原代细胞的培养与建系32

第一节　原代细胞的取材32

一、取材的基本要求32

二、各类组织的取材技术33

第二节　原代细胞的分离和制作34

一、悬浮细胞的分离方法34

二、实体组织材料的分离方法34

三、原代细胞的培养方法38

第三节　原代和传代细胞的培养和维持40

一、原代细胞的培养与维持40

二、原代细胞培养的首次传代42

三、传代细胞的传代培养42

四、传代细胞的建系和维持43

第四节　原代细胞的纯化和克隆44

一、细胞的纯化44

二、细胞的克隆46

第五章 正常细胞的培养50

第一节　上皮细胞的培养50

一、表皮细胞分离培养51

二、乳腺上皮细胞分离培养52

三、子宫颈上皮细胞分离培养52

四、肝细胞分离培养53

五、胰腺细胞分离培养54

六、气管及支气管上皮细胞分离培养54

七、前列腺细胞培养55

八、口腔黏膜上皮细胞培养55

九、胃上皮细胞培养56

第二节　中胚层细胞培养57

一、结缔组织细胞培养57

二、肌肉组织细胞培养61

三、各种骨细胞分离培养62

四、骨髓细胞分离培养65

五、内皮细胞分离培养68

六、血细胞分离培养69

第三节　神经外胚层细胞培养73

一、神经细胞分离培养73

二、神经胶质细胞分离培养74

第四节　眼细胞培养74

一、概述74

二、眼细胞培养类型及方法77

第六章　干细胞的培养85

第一节　干细胞的概念和来源85

一、干细胞的概念85

二、干细胞的来源85

第二节　胚胎干细胞培养86

一、胚胎干细胞的特性和分化潜能86

二、胚胎干细胞的建系88

三、胚胎干细胞的培养89

第三节　造血干／祖细胞培养90

一、造血干／祖细胞的生物学特性及研究方法91

二、造血祖细胞培养技术92

三、造血干／祖细胞的分离纯化101

四、造血干／祖细胞的体外扩增103

五、造血干／祖细胞体外扩增的临床应用106

第四节　神经干细胞的分离和培养108

一、神经干细胞生物学特性108

二、影响神经干细胞分化的因素109

三、神经干细胞的培养技术109

四、神经干细胞培养的意义及应用113

第七章 昆虫、 鱼及其他动物细胞的培养115

第一节　昆虫细胞的培养115

一、鳞翅目昆虫细胞原代培养的基本方法115

二、鳞翅目昆虫细胞系的建立119

三、昆虫缺陷型细胞株的建立120

第二节　鱼类细胞培养123

一、鱼类组织细胞培养124

二、鱼类血细胞培养方法125

第三节　中华鳖胚胎细胞培养126

一、中华鳖胚胎细胞的原代培养126

二、中华鳖胚胎细胞的传代培养126

三、中华鳖胚胎细胞培养应注意的问题126

第八章 肿瘤细胞的诱导分化和培养127

第一节　肿瘤细胞的培养127

一、肿瘤细胞的生物学特性127

二、肿瘤细胞的生物学特性的检测128

三、肿瘤细胞的取材和培养129

第二节　肿瘤细胞的诱导分化134

一、白血病细胞的诱导分化135

二、实体瘤细胞的诱导分化135

三、肿瘤细胞体内分化诱导实例137

第九章 细胞培养的污染及控制139

第一节　污染的类型139

一、细菌污染139

二、真菌污染139

三、支原体污染139

四、病毒污染139

五、其他污染140

第二节　污染来源及鉴别140

一、污染来源140

二、污染的鉴别141

第三节　污染的清除和预防142

一、污染的清除142

二、污染的预防143

第十章 细胞的冷冻保存复苏技术144

第一节　细胞的冻存144

一、概述144

二、主要冷冻设备和材料144

三、细胞冻存方法144

第二节　细胞的复苏145

一、细胞复苏的原则145

二、细胞复苏的主要操作步骤145

三、复苏时的注意事项145

第三节　细胞的运输146

一、冷冻储存运输146

二、充液法146

第十一章 培养细胞观察与检测方法147

第一节　培养细胞的常规检查和观察方法147

一、肉眼观察147

二、显微镜观察147

三、细胞的生长状态的观察147

四、微生物污染的观察148

第二节　培养活细胞的观察方法148

一、相差显微镜直接观察法148

二、暗视野显微镜观察活细胞149

三、缩时显微摄影观察149

四、离体活细胞染色观察150

第三节　细胞固定观察法150

一、细胞固定基本方法150

二、常用染色方法150

三、特殊染色方法152

第四节　细胞生长状况有关指标的检测方法156

一、细胞计数156

二、细胞生长曲线和生长倍数156

三、细胞分裂指数156

四、细胞接种存活率157

五、克隆形成率157

第五节　细胞生物活性的化学检测法158

一、四唑盐（MTT）比色法158

二、细胞蛋白质含量测定法（考马斯亮蓝测定法）159

三、细胞蛋白质合成测定法（3H-亮氨酸掺入法）159

四、细胞DNA合成测定法159

第六节　电子显微镜观察法160

一、透射电子显微镜细胞样品制备技术和观察方法161

二、扫描电子显微镜细胞样品制备162

第七节　激光扫描共聚焦显微镜观察法163

一、激光扫描共聚焦显微镜基本结构163

二、激光扫描共聚焦显微镜使用步骤164

三、激光扫描共聚焦显微镜功能165

第二篇　细胞工程常用专门技术167

第十二章 细胞染色体检测和荧光原位杂交技术167

第一节　性染色质检测167

一、X染色质显示法167

二、Y染色质显示法168

第二节　培养细胞染色体显示方法168

一、原理168

二、传代细胞染色体检测169

三、微量外周血白细胞染色体检查169

四、羊水细胞培养169

第三节　染色体结构显示和检测169

一、染色体显带原理和种类169

二、染色体显带方法要点170

三、常用染色体显带法170

四、姐妹染色单体分化染色171

第四节　荧光原位杂交技术172

一、探针的类型和制备172

二、荧光素标记原位杂交的方法173

三、荧光原位杂交的基本步骤174

四、染色体荧光原位杂交基本步骤176

五、影响荧光原位杂交实验结果的因素176

六、荧光原位杂交技术的优点和存在的主要问题177

第十三章 体外培养细胞的转化和转化灶的分离培养178

第一节　细胞转化的概念、方式和过程178

一、细胞转化与恶变的区别178

二、细胞转化的方式178

三、细胞转化的基本过程179

第二节　转化细胞的诱变因素及选择180

一、诱变剂的选择180

二、转化细胞的选择和常用的细胞种类180

第三节　细胞转化方法和转化灶的分离纯化181

一、细胞转化方法181

二、转化灶的分离182

三、转化细胞的筛选182

第四节　几种常用细胞转化技术实例183

一、化学致癌物转化细胞183

二、病毒转化细胞184

第十四章 DNA损伤和细胞凋亡检测技术185

第一节　DNA损伤检测技术185

一、DNA片段分析——DNA梯形条带分析185

二、DNA断裂检测186

第二节　细胞凋亡及其检测技术190

一、细胞凋亡的特征191

二、细胞凋亡的分子机制191

三、细胞凋亡的医学意义194

四、细胞凋亡试验常用的方法195

五、bcl-2凋亡基因表达的检测197

六、JAM检测技术199

第十五章 细胞融合、单克隆抗体的杂交瘤技术和生产技术201

第一节　细胞融合201

一、常用细胞融合剂201

二、细胞融合方式201

第二节　单克隆抗体的杂交瘤技术202

一、单克隆抗体技术基本原理202

二、单克隆抗体技术的特点203

三、单克隆抗体技术的应用203

四、杂交瘤细胞制备的操作程序204

第三节　单克隆抗体生产技术211

一、牛淋巴液体外循环培养法211

二、微囊培养法（micro-encapsu lation）211

三、含血清的杂交瘤细胞大量培养法212

四、无血清的杂交瘤细胞培养法212

五、工业化悬浮培养生产单克隆抗体的工艺流程212

第十六章 细胞毒试验技术和药物敏感试验的细胞培养法214

第一节　癌细胞的杀伤研究214

一、癌细胞杀伤研究的种类214

二、细胞毒试验215

第二节　药物敏感试验的细胞培养法218

一、细胞培养在药物敏感试验中的作用218

二、药物敏感试验方法219

三、不同抗癌药物的生物效应指标的选择223

第十七章 病毒研究中应用的细胞培养技术和疫苗生产技术225

第一节　细胞培养用于病毒研究的优点225

第二节　用细胞培养技术分离病毒225

一、接种标本的处理225

二、病毒的细胞培养226

三、在细胞培养中病毒作用之识别227

四、在单层细胞上滴定病毒227

第三节　病毒的鉴定技术227

一、病毒蚀斑技术227

二、病毒蚀斑抑制试验230

三、细胞培养系统中的中和试验231

四、用细胞培养法制备病毒血清学抗原应注意的问题232

第四节　病毒和疫苗的生产制备技术233

一、病毒的生产制备233

二、病毒疫苗的生产制备234

第十八章　细胞因子239

第一节　细胞因子概况239

一、细胞因子研究概况239

二、细胞因子的特点239

三、各类细胞因子特性和功能240

四、细胞因子的医学意义及其应用245

第二节　细胞因子的诱导表达246

一、白细胞介素类的诱生246

二、集落刺激因子类的诱生248

三、肿瘤坏死因子的诱生249

四、干扰素的诱生和制备249

第三节　细胞因子的效价测定253

一、细胞因子效价测定的原理253

二、细胞因子效价测定方法253

第十九章 细胞基因分离鉴定和原位杂交267

第一节　细胞DNA、RNA的分离鉴定技术267

一、培养细胞基因组DNA的提取及鉴定267

二、培养细胞总RNA的提取及鉴定268

第二节　核酸、蛋白质转移电泳及杂交269

一、DNA Southern Blot及杂交269

二、RNA Northern Blot及杂交271

三、蛋白质Western Blot及分析272

第三节　荧光定量PCR技术273

一、主要应用技术原理和特点273

二、实验仪器277

三、荧光定量的主要应用领域277

第四节　细胞的原位杂交技术278

一、探针的制备原则和选择279

二、载玻片和盖玻片的预处理279

三、组织细胞固定279

四、原位杂交280

第二十章 基因细胞内转导技术283

一、基本概念283

二、物理、化学法基因转染技术284

三、逆转录病毒载体介导DNA转染288

四、转染细胞鉴定292

第二十一章 流式细胞仪技术294

一、样品的制备294

二、悬浮细胞的固定294

三、流式细胞仪分析的应用295

第三篇　细胞工程生产应用技术300

第二十二章 大规模生产细胞技术300

第一节　培养要素控制及其参数的测定301

一、细胞的定量测定301

二、培养要素控制301

第二节　大规模培养系统应采取的措施303

第三节　大规模生产细胞的方法304

一、单层静置贴壁培养法304

二、固定化培养法306

三、悬浮培养324

第二十三章 细胞工程的应用340

第一节　在细胞生物学、组织胚胎学和药学方面的应用340

一、在细胞生物学方面的应用340

二、在组织胚胎学方面的应用341

三、在药物学和药理学方面的应用341

第二节　在肿瘤研究方面的应用342

一、肿瘤病因和发病机制的研究342

二、抗癌药物筛选方面的研究342

三、癌基因和抑癌基因方面的研究343

四、癌细胞的诱导分化和逆转方面的研究343

五、癌细胞的杀伤效应的研究343

第三节　在免疫学中的应用344

一、免疫细胞表面标记和功能的常规检测344

二、白细胞分化抗原的分类和主要特征344

三、单核-吞噬细胞的培养和功能的测定345

四、免疫细胞毒试验360

五、在HLA抗原检测中的应用360

六、在器官和组织移植免疫中的应用362

第四节　在临床各科中的应用363

一、在外科的应用363

二、在内科的应用363

三、在妇产科的应用364

附录365

附录1 人和动物的主要细胞系（株）　365

附录2 离心速度和离心力换算表　368

附录3　常用人工合成细胞培养基　369

附录4　细胞培养常用名词解释　370

附录5　细胞培养常用的溶液　379

附录6 中国典型培养物保藏中心细胞库可供细胞目录　382

附录7 中国科学院上海细胞生物学研究所细胞库可供细胞目录　385

参考文献　388