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绪论1

一、人类对生殖活动的认知1

二、生殖细胞3

三、哺乳动物个体发生3

四、生殖生物技术的发展4

五、生殖生物技术在动物繁殖中的应用9

六、生殖生物学基础研究的热点与发展趋势10

参考文献12

第一章 卵母细胞体外成熟13

第一节 卵母细胞成熟的特征13

一、卵丘细胞的成熟13

二、透明带的成熟15

三、卵母细胞的细胞膜成熟16

四、卵母细胞的细胞核成熟18

五、卵母细胞的细胞质成熟22

第二节 卵母细胞体外成熟培养25

一、卵巢卵母细胞的收集25

二、卵母细胞成熟培养操作27

三、小鼠卵母细胞体外成熟培养操作要点29

四、家畜卵母细胞体外成熟培养操作要点29

第三节 卵母细胞的质量评价方法30

一、物理方法31

二、化学方法33

三、体外受精、体外胚胎培养评定法35

第四节 影响卵母细胞体外成熟的因素35

一、影响卵母细胞体外成熟的主要因素35

二、促进卵母细胞体外成熟的措施39

参考文献40

第二章 体外受精43

第一节 哺乳动物体外受精的研究简史43

第二节 精液与精子的生物学特性46

一、精液的主要常规参数46

二、有关精子的一些生物学数据49

第三节 精子获能51

一、精子获能原理51

二、精子获能处理54

三、提高精子活力的措施59

四、精子获能的检测59

五、影响精子体外获能的因素62

六、体外诱导顶体反应63

第四节 实验动物的体外受精操作65

一、小鼠的体外受精操作65

二、大鼠的体外受精操作69

三、兔的体外受精操作72

第五节 家畜的体外受精操作74

一、牛的体外受精操作74

二、绵羊与山羊的体外受精操作78

三、猪的体外受精操作79

四、不同动物体外受精操作的主要参考指标83

第六节 显微受精83

一、显微受精研究概况83

二、ICSI操作过程85

三、影响显微受精的因素89

四、ICSI的转基因应用91

参考文献91

第三章 胚胎体外生产94

第一节 哺乳动物早期胚胎发育95

一、母源—合子基因转变95

二、致密化的桑椹胚形成100

三、囊胚形成机制102

四、囊胚孵化机制104

五、胚胎的细胞凋亡106

第二节 胚胎体外发育阻滞与胚胎能量代谢107

一、胚胎体外发育阻滞现象和机理107

二、胚胎体外发育阻滞的克服109

三、早期胚胎发育的能量代谢途径111

第三节 培养系统112

一、培养用具的选择与要求112

二、气相条件113

三、培养温度114

四、光照115

五、湿度115

六、培养液115

第四节 胚胎培养液115

一、几种动物输卵管液的化学成分116

二、培养液的种类和组成117

三、培养液中主要成分的作用126

四、培养液的配制方法128

第五节 胚胎收集与胚胎培养体系129

一、胚胎收集129

二、胚胎培养体系132

第六节 胚胎质量评价136

一、胚胎细胞计数方法137

二、胚胎细胞计数具体操作139

三、胚胎与胎儿细胞的染色体分析技术141

四、囊胚辅助孵化技术143

五、胚胎细胞凋亡检测分析技术145

六、哺乳动物早期胚胎蛋白质组学分析147

七、代谢组学的胚胎质量评估149

八、多潜能基因表达检测技术150

第七节 胚胎体外生产与应用技术体系151

一、牛胚胎体外生产技术体系151

二、绵羊胚胎体外生产技术体系158

三、山羊胚胎体外生产技术体系162

参考文献165

第四章 孤雌生殖与孤雄生殖168

第一节 单性生殖的研究简史168

一、朱冼与他的单性繁殖研究168

二、哺乳动物的单性生殖研究169

第二节 孤雌激活与孤雌生殖170

一、孤雌激活的机理170

二、孤雌激活的方法172

三、孤雌激活操作174

四、卵母细胞孤雌激活的类型176

五、孤雌胚的发育177

第三节 孤雄生殖178

一、孤雄胚胎的制作方法178

二、孤雄胚胎的发育180

三、孤雄胚胎干细胞181

四、单倍体胚胎干细胞181

参考文献183

第五章 动物克隆技术186

第一节 细胞核移植的研究简史187

一、细胞核移植技术设想的提出187

二、无尾两栖动物细胞核移植研究188

三、鱼类细胞核移植研究189

四、哺乳类细胞核移植研究190

五、异种动物的核移植192

第二节 细胞核移植的基本程序192

一、供体细胞的选择192

二、受体胞质的选择194

三、受体胞质与供体核的细胞周期同步性195

四、核移植操作196

五、细胞融合198

六、克隆胚胎激活200

七、克隆胚胎培养203

八、克隆胚胎移植204

九、克隆动物鉴定204

第三节 小鼠体细胞核移植技术204

一、小鼠核移植操作的基本程序204

二、显微注射针的准备206

三、去核针或注核针的安装及Piezo调试207

四、卵母细胞的收集208

五、去核操作209

六、供核体细胞的准备210

七、供体核注射210

八、融合胚的激活和培养211

九、克隆胚胎的移植213

第四节 牛体细胞核移植技术213

一、卵母细胞的成熟培养213

二、体细胞培养与供核体细胞的选择215

三、去核操作218

四、注核操作219

五、融合219

六、融合胚的激活219

七、胚胎培养和囊胚质量鉴定221

八、囊胚的核型分析221

九、胚胎移植和妊娠检查222

十、克隆牛生产与克隆犊牛护理223

十一、克隆牛的繁殖与应用227

第五节 羊与其他动物的体细胞核移植技术227

一、羊克隆技术要点228

二、猪克隆技术要点232

三、马（或骡）克隆技术要点234

四、克隆动物研究进展236

第六节 影响体细胞核移植的因素237

一、体细胞克隆存在的主要问题237

二、影响克隆效率的因素239

第七节 克隆动物的健康与食品安全性244

一、克隆动物的健康244

二、克隆动物的行为245

三、克隆动物的生态适应性246

四、克隆动物的食品安全250

第八节 异种核移植251

一、异种核移植的研究历史251

二、异种核移植胚胎基因组激活和基因表达252

三、异种核移植胚胎线粒体异质性253

第九节 胚胎分割254

一、胚胎分割方法255

二、分割胚的发育257

三、胚胎分割技术存在的问题259

四、胚胎分割技术的意义259

第十节 嵌合体制作技术260

一、嵌合体研究的目的与意义260

二、嵌合体的制作方法260

三、嵌合体分析264

四、嵌合体技术的意义265

参考文献266

第六章 性别决定与性控技术275

第一节 哺乳动物性别决定原理276

一、性染色体上的性别决定基因278

二、Sry是TDF的证据280

三、与睾丸决定有关的基因282

四、与卵巢决定有关的基因284

五、SRY的作用及性腺细胞间的相互作用286

六、动物性别决定模型287

第二节 哺乳动物胚胎性别鉴定的传统方法288

一、细胞遗传学方法288

二、免疫学方法（H-Y抗原法）289

三、H-Y＋精子与H-Y-精子的分离290

四、X染色体相关酶法鉴定胚胎性别291

五、分子生物学方法292

六、SRY-PCR法293

七、其他方法294

第三节 X精子、Y精子分离技术295

一、分离精子的理论基础296

二、精液分离速度298

三、分离精子准确率的评价方法299

四、性控精液的产犊准确率301

第四节 性控精液的应用301

一、分离精子的人工输精302

二、性控精液的体外受精302

三、性控精液在奶牛生产中的应用303

四、性控冷冻精液存在的问题303

五、受精环境对哺乳动物性别形成的影响304

参考文献306

第七章 配子与胚胎保存311

第一节 胚胎的短期保存311

一、异种动物体内保存312

二、胚胎的低温保存313

第二节 程序化超低温冷冻保存技术316

一、超低温冷冻保存的原理316

二、冷冻保护剂318

三、冷冻保存的方法320

四、冷冻保存的操作程序321

五、冷冻胚胎解冻后的活力鉴定325

六、程序化胚胎冷冻研究进展325

第三节 玻璃化冷冻保存技术329

一、玻璃化冷冻保存的原理329

二、玻璃化冷冻保存的操作要求330

三、玻璃化冷冻方法330

四、玻璃化冷冻保存具体操作332

五、影响玻璃化冷冻效果的可能因素334

六、玻璃化冷冻保存技术研究进展336

第四节 卵母细胞的冷冻保存338

一、卵母细胞的冷冻损伤339

二、卵母细胞冷冻保存操作341

三、卵母细胞冷冻保存进展与存在的问题343

第五节 精液的冷冻保存345

一、精液的冷冻过程及其对精子的损伤346

二、精液稀释液中的添加剂348

三、牛冷冻精液生产操作过程350

四、羊冷冻精液生产操作过程352

五、猪冷冻精液生产操作过程354

六、精液冷冻保存的发展趋势356

参考文献357

第八章 配子与胚胎发生的表观遗传学363

第一节 表观遗传学原理364

一、DNA甲基化与去甲基化364

二、组蛋白修饰367

三、染色质重塑372

四、假基因378

五、非编码RNA379

第二节 配子发生过程中的表观遗传现象382

一、PGC分化过程存在广泛的表观遗传修饰382

二、雌雄生殖细胞印记的重建385

三、精母细胞减数分裂过程中的表观遗传修饰386

四、卵母细胞减数分裂过程中的表观遗传修饰387

五、DNA羟甲基化修饰389

第三节 胚胎发育过程中的表观遗传学修饰390

一、胚胎早期发育过程中的基因组DNA甲基化修饰391

二、胚胎发育过程中的DNA羟甲基化修饰392

三、胚胎发育过程中的组蛋白修饰变化393

四、克隆胚胎中的表观遗传修饰396

五、异种核移植胚胎的核重塑401

第四节 表观遗传系统的生物学意义403

一、表观遗传学与疾病403

二、环境对表观遗传学的影响408

三、表观遗传学在动物繁殖领域的应用前景408

参考文献409

第九章 组学大数据解析生殖发育调控416

第一节 大数据与生命科学417

一、大数据时代417

二、大数据处理算法和软件418

三、生物大数据的特征和应用419

四、大数据“干”实验生物学421

五、大数据生物学的发展趋势422

第二节 大数据生物信息技术423

一、生物信息学的多学科本质423

二、生物信息技术的发展概况424

第三节 大数据调控网络分析方法426

一、系统生物学与模块化调控426

二、基因模块聚类识别方法428

第四节 组学技术概述433

一、基因组测序技术434

二、基因组研究策略438

三、转录组技术442

四、表观遗传组技术444

五、蛋白质组技术446

六、单细胞测序技术447

第五节 配子发生的组学研究448

一、精子发生的组学研究448

二、卵子发生的组学研究450

三、胚胎内生殖细胞遗传图谱解密453

四、配子发生相关数据库454

第六节 哺乳动物胚胎发育多层次协同调控454

一、关键基因表达模块的精确化开启是早期胚胎正常发育的关键455

二、非编码RNA调控早期胚胎发育459

三、表观遗传修饰通过有序地开启/关闭基因表达来调控早期胚胎发育462

四、染色质DNA空间局域构象是关键转录因子调控基因表达和表观遗传修饰基因组DNA的充分条件463

参考文献464

第十章 动物的发情周期与同期发情469

第一节 生殖激素470

一、生殖激素的作用特点470

二、主要的生殖激素470

三、各生殖激素之间的相互关系473

第二节 动物的发情周期与发情调控473

一、家畜的发情周期473

二、实验动物的发情周期474

三、动物季节性发情的调控474

第三节 发情周期内卵泡发育过程与发育模式479

一、哺乳动物卵泡发育和卵子发生479

二、卵泡发育和卵子发生有关的候选基因481

第四节 诱导发情482

一、发情调控理论482

二、乏情期动物的诱导发情483

三、催产素诱导发情485

四、褪黑素诱导发情486

第五节 同期发情487

一、同期发情的原理488

二、同期发情的药物488

三、同期发情方法489

四、影响同期发情的因素491

五、发情鉴定492

六、提高母畜繁殖率的措施494

参考文献494

第十一章 胚胎移植496

第一节 胚胎移植的生理学基础与基本原则496

一、胚胎移植496

二、胚胎移植技术的生理学原理498

三、胚胎移植的基本原则500

四、胚胎移植的内容501

五、胚胎移植的意义501

第二节 供体动物的超数排卵502

一、供体选择与饲养管理502

二、超数排卵处理503

三、超数排卵遇到的问题507

第三节 人工授精与胚胎收集509

一、母牛发情鉴定509

二、人工授精技术510

三、胚胎收集511

四、拣胚技术518

五、胚胎质量分级519

第四节 受体动物的同期发情处理522

一、受体选择522

二、受体饲养管理523

三、同期发情处理523

第五节 胚胎移植的技术程序524

一、手术法移植525

二、非手术法移植527

三、妊娠检查529

四、妊娠受体的饲养管理529

第六节 影响胚胎移植成功率的因素530

一、供体方面530

二、受体方面532

三、操作技术问题533

参考文献534

第十二章 妊娠、分娩与产后母畜生殖调控535

第一节 妊娠与围产期饲养管理535

一、妊娠期母畜的饲养管理536

二、围产期母畜的饲养管理537

第二节 分娩调控541

一、诱导分娩的意义541

二、诱导分娩的原理541

三、诱导分娩的方法542

四、分娩助产543

第三节 哺乳母畜与初生幼畜的管理545

一、哺乳母牛与初生犊牛的管理与护理546

二、哺乳母羊与初生羔羊的管理与护理547

三、产后母猪与仔猪的管理与护理548

第四节 母畜产后生殖器官的生殖机能调控549

一、影响子宫恢复的因素549

二、牛产后子宫机能监测552

三、促进母牛产后子宫恢复的保健技术554

参考文献554

第十三章 胚胎干细胞556

第一节 干细胞及其生物学特性557

一、干细胞557

二、干细胞的生物学特性557

三、干细胞的应用558

四、干细胞研究大事记559

第二节 胚胎干细胞的获取和基本特征560

一、胚胎干细胞的获取途径560

二、胚胎干细胞的研究现状563

三、胚胎干细胞的分子标记566

四、胚胎干细胞的生物学特性567

第三节 胚胎干细胞的分化能力569

一、向生殖细胞的定向分化570

二、向造血细胞的定向分化571

三、向内皮细胞的定向分化571

四、向肝细胞的定向分化572

五、向胰岛细胞的定向分化572

六、向心肌细胞的定向分化572

七、向神经细胞的定向分化573

八、向其他细胞的定向分化573

第四节 饲养层细胞的制备574

一、饲养层细胞培养液574

二、原代胎儿成纤维细胞的制备574

三、细胞传代和冷冻保存575

四、细胞解冻和培养576

五、饲养层的制备576

第五节 小鼠胚胎干细胞的分离和培养576

一、小鼠胚胎干细胞培养液577

二、小鼠胚胎干细胞的分离和培养577

三、小鼠胚胎干细胞的鉴定578

第六节 大鼠胚胎干细胞的分离与培养583

一、小鼠与大鼠胚胎干细胞多能性信号通路583

二、大鼠3i胚胎干细胞培养体系584

三、具有种系嵌合能力的大鼠胚胎干细胞培养体系585

四、大鼠干细胞的转基因模型应用588

第七节 人胚胎干细胞的分离、培养和鉴定589

一、人组织的饲养层细胞制备589

二、胚胎干细胞的分离与培养590

三、hES细胞的生物学鉴定593

四、无血清无饲养层细胞的干细胞培养体系595

第八节 胚胎干细胞的应用及存在问题597

一、ES细胞的应用研究现状597

二、存在的问题599

参考文献600

第十四章 组织干细胞607

第一节 间充质干细胞609

一、骨髓间充质干细胞609

二、骨髓间充质干细胞的分离与培养612

三、间充质干细胞的应用616

第二节 肌肉卫星细胞617

一、肌肉卫星细胞的分离617

二、肌肉卫星细胞的鉴定619

三、肌肉卫星细胞的诱导分化619

四、肌肉卫星细胞的发展趋势623

第三节 其他组织干细胞624

一、脂肪干细胞624

二、脐带血干细胞628

三、羊水干细胞630

四、毛囊干细胞632

五、肝干细胞635

六、胰腺干细胞637

七、组织干细胞的发展趋势639

参考文献643

第十五章 精原干细胞647

第一节 精原干细胞的来源647

一、精原干细胞的发生647

二、精原干细胞的特征648

三、SSC的分子标记及纯化649

四、SSC微环境651

第二节 精原干细胞的分离、培养与鉴定653

一、小鼠精原干细胞的分离培养与鉴定653

二、绵羊精原干细胞的分离655

三、山羊精原干细胞的培养与鉴定657

四、牛精原干细胞的分离培养与鉴定662

第三节 精原干细胞自我更新的调控机制665

一、影响精原干细胞自我更新的相关因子665

二、影响精原干细胞自我更新的相关基因666

三、影响精原干细胞自我更新的相关小RNA668

四、影响精原干细胞自我更新的相关通路669

五、表观遗传修饰对精原干细胞自我更新的影响671

参考文献671

第十六章 诱导干细胞678

第一节 诱导干细胞的产生679

一、细胞重编程的方法679

二、诱导干细胞技术680

三、重编程转录因子681

第二节 诱导多能干细胞研究进展683

一、iPS细胞的特性愈加接近胚胎干细胞683

二、iPS细胞诱导效率的提升684

三、iPS细胞诱导的生物安全性686

四、体细胞诱导重编程的分子机制689

五、家畜诱导多能干细胞研究概况694

六、多能干细胞的状态696

第三节 小鼠诱导多能干细胞的制备701

一、培养液、试剂及小鼠701

二、iPS细胞的诱导702

三、iPS细胞的多能性分析705

第四节 人诱导多能干细胞的制备707

一、细胞培养液707

二、需要的细胞株和载体708

三、人诱导多能干细胞的制备方法708

四、人iPS细胞的鉴定710

第五节 猪诱导多能干细胞的制备711

一、试剂与材料711

二、猪诱导多能干细胞的制备方法713

三、猪iPS细胞的鉴定714

第六节 牛诱导多能干细胞的制备715

一、牛羊膜来源诱导多能干细胞的制备715

二、biPS细胞的鉴定717

第七节 诱导多能干细胞的应用及存在问题719

一、诱导多能干细胞的应用719

二、iPS技术存在的问题721

三、干细胞技术成为第三次医学革命的主导技术722

参考文献723

第十七章 基因编辑技术730

第一节 基于同源重组的基因打靶技术731

一、基因打靶技术简介731

二、基因打靶技术流程731

三、应用与优缺点734

第二节 锌指核酸酶（ZFN）技术734

一、ZFN技术简介734

二、ZFN技术流程735

三、ZFN技术发展应用及特点737

第三节 类转录激活效应物核酸酶（TALEN）技术738

一、TALEN技术简介738

二、TALEN技术流程739

三、TALEN技术应用及特点743

第四节 CRISPR/Cas9技术744

一、CRISPR/Cas9技术简介744

二、CRISPR/Cas9技术流程744

三、CRISPR/Cas9技术的优化746

第五节 基因组编辑技术的比较和应用747

一、不同基因编辑技术的比较747

二、基因组编辑技术的应用进展748

参考文献753

第十八章 转基因小鼠制备技术757

第一节 小鼠的生物学特性与饲养管理758

一、小鼠的行为习性758

二、小鼠的生理学特点758

三、小鼠的饲养管理759

第二节 小鼠及其他实验动物的品系760

一、小鼠的近交系760

二、常用小鼠近交品系特征及用途简介762

三、常用小鼠封闭群768

四、常用杂交一代小鼠769

五、大鼠近交品系特征及用途772

六、实验兔品种778

七、实验犬品种780

八、实验猪品种781

第三节 小鼠超数排卵与输精管结扎手术783

一、小鼠的交配与超数排卵783

二、输精管结扎术786

第四节 原核注射技术788

一、显微注射DNA的准备789

二、液体配制791

三、小鼠受精卵的收集794

四、显微操作系统及注射针795

五、原核的显微注射798

六、胚胎培养799

第五节 胚胎移植与转基因鉴定799

一、假孕母鼠的准备799

二、输卵管移植800

三、子宫内移植801

四、转基因小鼠鉴定802

五、纯合子小鼠的培育803

第六节 原核注射制备转基因小鼠的技术优化804

一、质粒准备804

二、注射针的直径对转基因小鼠效率的影响804

三、注射的外源DNA浓度对转基因小鼠效率的影响804

四、单或双原核注射对转基因小鼠阳性率的影响805

五、母鼠的假孕时间对转基因小鼠生产的影响806

六、其他一些影响因素806

参考文献807

第十九章 家畜转基因技术809

第一节 动物转基因技术发展简史810

一、研究简史810

二、生物转基因技术发展的主要事件812

三、动物转基因技术发展的主要事件813

第二节 目的基因的操作814

一、基因分离814

二、利用PCR技术扩增目的基因816

三、DNA重组816

第三节 动物转基因操作技术820

一、原核注射法820

二、病毒载体法821

三、精原干细胞法822

四、精子载体法823

五、人工酵母染色体法824

六、体细胞克隆法825

七、RNA干扰825

第四节 家畜转基因研究概况826

一、转基因猪研究827

二、转基因牛研究833

三、转基因羊研究839

四、转基因家畜存在的主要问题842

第五节 转基因动物的生物安全843

一、转基因动物的生物安全844

二、转基因动物的食品安全846

三、转基因动物的安全评价849

参考文献857

第二十章 人类辅助生殖技术863

第一节 人类辅助生殖技术的历史和发展865

一、世界人类辅助生殖技术发展简史865

二、我国人类辅助生殖技术发展历史867

三、人类辅助生殖技术的主要内容868

第二节 人类辅助生殖中的促排原理及配子操作技术873

一、控制性超促排卵873

二、卵母细胞的采集与培养875

三、精液的采集及处理875

四、人类体外受精操作流程878

第三节 人类辅助生殖技术中的受精操作及胚胎培养878

一、IVF适应证及操作方法878

二、ICSI适应证及操作方法879

三、胚胎的体外培养及评分883

四、精子、卵子及胚胎的冷冻886

五、胚胎移植889

第四节 胚胎植入前遗传学诊断技术890

一、胚胎植入前遗传学活检技术概述890

二、胚胎植入前遗传学诊断的技术方法891

第五节 ART相关衍生技术的发展895

一、经形态学选择后的卵胞质内单精注射896

二、卵子辅助激活技术896

三、实时胚胎发育监测分析培养系统897

四、非侵入性胚胎分级体系897

五、卵母细胞老化与IVF-ET结局898

六、卵子胞质成熟及其对IVF-ET结局的影响899

七、卵子线粒体功能紊乱与卵子老化900

八、临床医学对扭转卵子老化采取的一些措施900

第六节 辅助生殖技术的子代健康分析901

一、不同辅助生殖技术的特点902

二、ART子代的安全性与健康903

三、ART子代的基因学研究907

四、ART对孕妇的影响909

五、人类辅助生殖技术的社会与伦理问题910

参考文献911

索引917