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目 录1

第一章分光光度技术1

第一节基本原理1

一、光的基本知识1

二、朗伯—比尔定律2

三、吸光系数3

第二节分光光度计的基本类型和组件3

一、分光光度计的基本类型3

二、分光光度计的基本组件5

第三节分光光度技术的应用6

一、定量分析6

二、定性分析7

第四节测试条件的选择8

一、测试波长的选择8

二、测量狭缝的选择8

一、物理性原因产生的误差9

第五节分光光度法的误差9

四、参比溶液的选择9

三、吸光度测量范围的控制9

二、化学性原因引起的误差10

第六节常见国产分光光度计的使用10

一、721型分光光度计10

二、722S型分光光度计11

三、日本岛津1240紫外／可见分光光度计（带Sipper 160型自动流动池）11

四、使用分光光度计的注意事项12

第二章色谱技术13

第一节色谱技术的概念和特点13

一、色谱技术的概念13

二、色谱技术的特点和优点13

三、色谱技术的不足14

第二节色谱法的分类14

一、按两相所处的状态分类14

二、按色谱的分离机制分类14

三、按操作形式不同分类15

一、色谱法中常用的术语16

第三节色谱的基本理论16

二、塔板理论18

三、速率理论19

四、分离度（resolution）——色谱分离效能的总指标22

第四节常用的色谱方法22

一、吸附色谱22

二、分配色谱24

三、凝胶色谱25

四、离子交换色谱30

五、亲和色谱33

六、高效液相色谱34

七、毛细管电泳37

第三章电泳技术42

第一节基本原理42

一、蛋白质电荷的来源42

二、电泳的基本原理43

三、影响电泳的因素43

第三节琼脂糖凝胶电泳45

第二节醋酸纤维薄膜电泳45

一、核酸分子大小与琼脂糖浓度的关系46

二、核酸构型与琼脂糖凝胶电泳分离的关系47

三、琼脂糖凝胶电泳基本方法简介47

第四节常规聚丙烯酰胺凝胶电泳48

一、聚丙烯酰胺凝胶聚合原理及相关特性48

二、聚丙烯酰胺凝胶电泳原理50

三、操作方法52

四、聚丙烯酰胺凝胶电泳中常见的问题及解决方法54

分子量的原理55

第五节SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳原理55

一、SDS-PAGE测定蛋白质55

二、分子量的测定和计算56

三、操作方法56

第六节聚丙烯酰胺梯度凝胶电泳57

第七节聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳58

一、等电聚焦的原理58

二、pH梯度的形成59

三、操作方法60

四、IEFPAGE中常见的问题及解决方法62

第八节双向电泳64

一、样品制备65

二、第一向等电聚焦65

五、蛋白质的检测及图谱数字化分析66

第九节染色方法66

一、蛋白质染色66

四、第二向SDS-PAGE66

三、平衡及二向间的转移66

二、脂蛋白染色68

三、核酸的染色69

第四章 离心技术70

第一节离心理论70

一、离心分离的原理70

二、沉降系数72

三、相对离心力和离心时间72

四、离心机的分类73

一、差速离心法74

第二节离心分离的种类74

二、密度梯度离心法75

第三节离心操作注意事项77

第五章 荧光分光分析技术78

一、荧光的产生78

二、荧光检测的类型78

三、荧光分析的基本参数80

四、环境因素对荧光分析的影响82

六、荧光分析仪器的基本结构83

五、荧光定量测定的方法83

七、几种不同类型的荧光分析测定装置84

第六章蛋白质组技术87

一、蛋白质组学87

二、蛋白质组分离技术87

三、蛋白质组分析技术89

四、蛋白质组数据库的建立90

五、蛋白质组研究的前景91

二、培养细胞的生长特点92

一、体外培养细胞的分型92

第七章细胞培养技术92

第一节细胞培养基本知识92

三、培养细胞的生长过程93

四、培养细胞生长的条件95

五、培养用液96

六、培养基96

第二节细胞培养的基本技术97

一、培养细胞的取材97

二、组织材料的分离98

三、原代培养98

四、传代培养和细胞系的维持98

五、细胞的冻存与复苏99

六、培养细胞的污染及检测99

第八章生物大分子制备技术100

第一节预处理和细胞的分离100

一、选择材料及预处理100

一、细胞的破碎101

第二节细胞的破碎及细胞器的分离101

二、细胞的分离101

二、细胞器的分离104

第三节生物大分子的提取、分离纯化和定量104

一、蛋白质（包括酶）的提取104

二、蛋白质的分离纯化105

三、核酸的分离纯化107

四、蛋白质的定量108

五、DNA、RNA的定量110

第四节浓缩、干燥及保存111

一、蛋白质的浓缩111

二、核酸的浓缩113

三、干燥115

四、保存115

第九章 重组DNA技术117

第一节 目的基因的获取117

四、构建基因组文库及cDNA文库118

三、用逆转录酶录制cDNA118

一、直接从染色体中分离118

二、化学合成法118

五、聚合酶链反应119

第二节分子克隆载体与宿主的选择119

一、质粒载体120

二、噬菌体121

三、噬菌粒122

四、粘粒122

五、DNA病毒载体SV40122

六、反转录病毒载体123

七、宿主细胞123

第三节分子克隆常用的工具酶124

一、限制性核酸内切酶124

二、DNA聚合酶127

一、限制性内切酶运用的设计128

第四节DNA限制性内切酶酶切及片断回收128

七、碱性磷酸酶128

六、脱氧核糖核酸酶128

五、核酸酶128

四、末端脱氧核苷酰转移酶128

三、DNA连接酶128

二、限制性内切酶的酶切129

三、琼脂糖凝胶电泳分离和DNA片断的回收130

四、琼脂糖凝胶中回收DNA片段的纯化133

第五节外源基因与载体的连接134

二、平末端的连接135

一、粘性末端连接135

三、DNA的胶内连接136

第六节重组DNA导入宿主细胞136

一、大肠杆菌的转化137

二、电脉冲穿孔法转化大肠杆菌138

第七节含重组质粒的宿主菌落的筛选与鉴定138

一、利用宿主细胞遗传表型的改变进行筛选139

二、分析重组子分子结构特性进行鉴定140

一、大肠杆菌表达载体的表达元件141

第一节大肠杆菌表达系统141

第十章外源基因表达技术141

二、大肠杆菌的表达载体142

三、外源基因在大肠杆菌中表达144

四、提高外源基因表达水平的措施145

第二节哺乳动物细胞表达系统146

一、真核表达载体147

二、目的基因148

三、外源基因导入哺乳动物细胞的方法148

四、哺乳动物基因转移的筛选标记149

五、外源基因在哺乳细胞的表达和基因表达产物的检测150

第十一章分子杂交技术151

第一节核酸杂交的基本理论——DNA变性与复性151

一、DNA变性151

二、DNA复性151

三、核酸分子杂交152

第二节核酸探针及其标记152

一、核酸探针152

二、探针标记物153

三、标记方法154

第三节核酸分子杂交155

一、影响杂交的因素156

二、固相杂交法157

三、液相杂交法160

第十二章聚合酶链反应（PCR）技术163

第一节PCR基本原理和影响因素163

一、基本原理163

三、影响因素164

二、PCR反应步骤简介164

四、PCR条件优化167

五、注意事项168

第二节逆转录PCR技术169

一、原理169

二、RNA的提取169

三、逆转录PCR反应170

一、原理171

第三节PCR——SSCP银染技术171

二、实验方法172

第四节PCR技术扩展174

一、反向PCR174

二、不对称PCR174

三、差异PCR174

四、复合PCR174

八、定量PCR175

七、竞争性PCR175

六、锚定PCR175

五、着色互补PCR175

九、原位PCR176

十、重组PCR176

十一、RNA扩增与一步法扩增（RT-PCR）177

第五节PCR技术应用177

一、DNA克隆177

二、重组PCR177

四、用于基因定量178

三、DNA序列的测定178

第十三章DNA序列测定179

第一节序列测定的技术和策略179

第二节Sanger双脱氧末端终止法测序179

第三节全自动激光荧光DNA测序182

第十四章生物芯片技术183

第一节生物芯片的概念和特点183

第二节生物芯片的分类183

第三节生物芯片的制备和检测184

一、芯片载体的表面修饰184

二、芯片阵列制作方式185

三、杂交探针的种类与制备186

四、样品制备和标记189

五、分子杂交和杂交微环境189

六、杂交信号采集和处理190

七、生物信息的分析和提取190

二、基因突变分析193

一、微缩实验室芯片193

第四节生物芯片在医学中的应用193

三、克隆选择及文库筛选194

四、测序芯片194

五、基因多态性分析195

六、基因表达谱分析195

七、微生物菌种鉴定、致病机理及抗药性分析195

八、药物筛选芯片196

第十五章生物化学与分子生物学实验实验一蛋白质的变性、凝固及沉淀反应197

实验二蛋白质的定量测定199

实验三血清白蛋白、γ－球蛋白的分离纯化及鉴定208

实验四双向电泳212

实验五碱性磷酸酶的分离纯化215

实验六鸡卵类粘蛋白的制备219

实验七质粒DNA的制备与纯化223

实验八DNA纯度、浓度与分子量的测定226

实验九DNA的限制性内切酶消化229

实验十从琼脂糖凝胶中分离回收DNA片段231

实验十一DNA片段的连接反应234

实验十二重组质粒DNA转化大肠杆菌236

实验十三含重组质粒的细菌菌落的鉴定238

实验十四哺乳类高分子量DNA的提取241

实验十五哺乳类细胞总RNA的提取244

实验十六DNA探针的标记246

实验十七Southern印迹法249

实验十八Northern印迹法253

实验十九斑点杂交和狭线杂交256

实验二十原位杂交258

实验二十一聚合酶链式反应（PCR）262

实验二十二DNA序列分析267

实验二十三免疫印迹法——WesternBlot271

实验二十四SSCP技术检测基因突变275

附 录278

附录一实验须知278

附录二常用试剂的配制285