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第一章 绪论4

1.1 tPA的研究进展4

1.1.1 tPA发展简史4

1.1.2 tPA的生物学活性5

1.1.3 tPA的功能及应用6

1.2 产蛋鸡卵黄中营养物的转运与沉积的研究8

1.2.1 apo-B100对VLDLy组装过程的影响8

1.2.2 VLDLy在卵黄中沉积的过程9

1.3 绿色荧光蛋白的研究进展11

1.3.1 绿色荧光蛋白的特点11

1.3.2 绿色荧光蛋白的应用12

1.4 减毒沙门氏菌载体系统15

1.4.1 沙门氏菌的侵入途径15

1.4.2 减毒沙门氏菌的研究16

1.4.3 减毒沙门氏菌作为载体的研究17

1.5 转基因家禽生物反应器的研究进展20

1.5.1 转基因动物作为生物反应器20

1.5.2 家禽作为生物反应器的独特优势21

1.5.3 家禽转基因技术面临的困境21

1.5.4 常规转基因动物技术在家禽转基因应用中的局限性23

1.6 利用转基因动物生物反应器生产tPA25

1.6.1 tPA在原核和真核细胞中的表达25

1.6.2 tPA在转基因动物乳腺中的表达25

1.6.3 tPA的纯化和检测26

1.7 问题与展望28

参考文献29

第二章 pCDNA3-apo-△tPA特异性表达载体的构建38

2.1 材料与方法38

2.1.1 主要试剂38

2.1.2 主要溶液及配制方法38

2.1.3 主要仪器设备40

2.1.4 DNA分析软件40

2.2 试验方法41

2.2.1 试验设计41

2.2.2 引物设计与合成42

2.2.3 对apo-B100和△tPA目的基因分别进行扩增、回收纯化、克隆43

2.2.4 连接产物的转化、质粒提取、酶切鉴定46

2.2.5 apo-△tPA基因融合与pCDNA3-apo-△tPA载体构建50

2.3 结果与分析51

2.3.1 目的基因的克隆和重组质粒的酶切鉴定51

2.3.2 pMD18-T-apo-△tPA和pMD18-T-△tPA质粒的酶切鉴定51

2.3.3 pMD18-T-apo-△tPA和pMD18-T-△tPA质粒的酶切鉴定52

2.4 讨论53

参考文献55

第三章 重组菌△crp SL1344（pEGFP-N1-apo-tPA）的构建55

3.1 材料60

3.1.1 主要试剂与实验动物60

3.1.2 主要溶液及配制方法60

3.1.3 主要仪器设备62

3.1.4 DNA分析软件62

3.2 试验方法63

3.2.1 基础载体和克隆载体63

3.2.2 构建pMD18-T-apo-tPA载体64

3.2.3 引物设计与合成64

3.2.4 apo-tPA基因的扩增、回收纯化、克隆64

3.2.5 连接产物的转化、质粒提取及鉴定66

3.2.6 apo-tPA融合基因与pEGFP-N1-apo-tPA表达载体构建69

3.2.7 重组菌△crp SL1344（pEGFP-N1-apo-tPA）的构建69

3.3 结果与分析71

3.3.1 目的基因的克隆71

3.3.2 pMD18-T-apo-tPA质粒的PCR鉴定和酶切鉴定71

3.3.3 pEGFP-N1-apo-tPA质粒的PCR鉴定和酶切鉴定72

3.3.4 重组菌△crp SL1344（pEGFP-N1-apo-tPA）鉴定73

3.4 讨论74

3.5 小结79

参考文献80

第四章 减毒鼠伤寒沙门氏菌△crp SL1344作为载体的研究84

4.1 材料与试剂84

4.1.1 材料84

4.1.2 主要培养基及抗生素的配制84

4.2 试验方法86

4.2.1 重组减毒沙门氏菌的稳定性86

4.2.2 重组菌的转染86

4.2.3 重组减毒沙门氏菌分布检测86

4.2.4 减毒鼠伤寒沙门氏菌作为载体的研究87

4.3 结果与分析88

4.3.1 重组减毒沙门氏菌的稳定性88

4.3.2 重组减毒沙门氏菌分布检测88

4.3.3 减毒鼠伤寒沙门氏菌作为载体的研究89

4.4 讨论91

4.5 小结93

参考文献94

第五章 重组菌△crp SL1344（pEGFP-N1-apo-tPA）在鸡胚成纤维细胞的表达检测94

5.1 材料98

5.1.1 试验材料98

5.1.2 主要试剂98

5.2 试验方法102

5.2.1 鸡胚成纤维细胞的分离和体外培养102

5.2.2 重组菌△crp SL1344（pEGFP-N1-apo-tPA）感染鸡胚成纤维细胞103

5.2.3 鸡胚成纤维细胞中表达产物的定性检测103

5.2.4 鸡胚成纤维细胞中表达产物的ELISA检测104

5.2.5 鸡胚成纤维细胞中表达产物的体外活性检测105

5.3 结果与分析106

5.3.1 鸡胚成纤维细胞的体外培养106

5.3.2 表达产物的SDS-PAGE电泳检测107

5.3.3 表达产物的荧光显微镜检测107

5.3.4 表达产物的ELISA检测107

5.3.5 表达产物的活性检测108

5.4 讨论109

5.5 小结112

参考文献113

第六章 重组菌△crp SL1344（pEGFP-N1-apo-tPA）在鸡体内表达及卵黄中沉积113

6.1 试验方法119

6.1.1 材料119

6.1.2 主要器械及仪器119

6.1.3 主要溶液及配制方法119

6.2 试验方法121

6.2.1 采用减毒鼠伤寒沙门氏菌介导法121

6.2.2 融合蛋白在鸡蛋中的定性表达检测121

6.2.3 融合蛋白在鸡蛋中的定量检测122

6.2.4 融合蛋白在卵黄中的活性表达检测123

6.3 结果分析124

6.3.1 卵黄中融合蛋白的SDS电泳及其荧光镜检124

6.3.2 apo-tPA-GFP融合蛋白在卵黄表达含量的检测125

6.3.3 融合蛋白在卵黄中的活性表达检测126

6.4 讨论127

6.5 小结134

参考文献135

第七章 展望142

参考文献142

附录147

附录一 英文缩写词表147

附录二 pMD 18-T Vector碱基序列149

附录三 pcDNA3.1 （-）碱基序列152

附录四 pEGFP-N1载体序列157

附录五 tPA碱基序列161

附录六 tPA氨基酸序列164

附录七 apo碱基序列165

附录八 apo氨基酸序列175

后记179